PPARγ、PTEN、Akt在胃癌中的表達及其與胃癌生物學行為的關(guān)系

廖山嬰 朱小波 王蓓蓓 馬娟 沙衛(wèi)紅

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來胃癌患病率有逐年上升趨勢，且發(fā)病日益年輕化，嚴重影響人民健康，目前胃癌的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明[1］。近年來過氧化物酶增殖激活受體γ（PPARγ）與腫瘤關(guān)系的研究受到廣泛關(guān)注，許多惡性腫瘤中存在PPARγ的異常表達，PPARγ被配體激活后可抑制腫瘤生長[2-3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體羅格列酮具有預(yù)防化學致癌劑N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍誘導(dǎo)大鼠腺胃癌發(fā)生的作用[4］。PPARγ2 Pro12Ala基因多態(tài)性與我國漢族人群胃癌的發(fā)生有關(guān)，增加幽門螺桿菌（Hp）感染后胃癌發(fā)生的危險性[5］。以上結(jié)果表明PPARγ與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而PPARγ在體內(nèi)的研究還鮮有報道。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法（RTPCR）檢測胃癌組織中PPARγ及10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因（PTEN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）mRNA的表達，并結(jié)合胃癌患者的臨床病理特征，分析三者的關(guān)系及其與胃癌生物學行為的相關(guān)性。

材料與方法

一、材 料

選取2010年10月至2012年10月我院胃腸外科行胃癌根治術(shù)并均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為胃癌標本60例，相應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤邊緣≥5 cm，手術(shù)后證實殘端無癌殘留）60例，組織取材后立即放入液氮凍存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊咝g(shù)前均未予放射化學治療。其中男38例，女22例；年齡33～72歲，中位年齡53歲；高、中分化腺癌36例，低分化腺癌24例；臨床分期采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）胃癌TNM 分期方法，其中Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例；遠處轉(zhuǎn)移13例，無遠處轉(zhuǎn)移47例；腫瘤浸潤未侵及漿膜層者26例，浸潤超過漿膜層者34例。另取本院同期胃鏡室的鏡下活檢20名正常胃黏膜標本（胃鏡標本）作為正常對照。所有取材患者均知情同意。

二、研究方法

1.主要試劑

RNA抽提試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Trizol RNA提取液、RNA酶抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA Ladder Marker購自Invitrogen；EDTA、DEPC購自Sigma；Taq DNA聚合酶、dNTP購自Promega；電泳儀和凝膠成像掃描分析儀購自美國Bio Rad；PCR擴增儀9600購自美國PE公司；紫外分光光度計DU70購自美國Beckman公司；臺式低溫高速離心機購自Eppendorf。引物設(shè)計參照Genebank資料，由計算機軟件設(shè)計，中山大學達安基因生物技術(shù)有限公司合成，擴增用引物見表1。

2.方 法

2.1 總RNA的提取和cDNA合成 按照RNA提取試劑盒說明書提取3組標本組織總RNA，RNA純度OD260/OD280在1.8～2.0。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA合成，-20℃保存。

2.2 RT-PCR擴增 PCR反應(yīng)體系組成：cDNA模板1μl，5×PCR buffer 5μl，上游引物1μl，Taq酶2.5 ul，10mM dNTPs 1μl，加去離子水補至20μl。反應(yīng)條件：95℃熱啟動15 min，93℃預(yù)變性3 min，93℃變性45 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后72℃充分延伸10 min。完畢后取擴增產(chǎn)物5μl，加6×上樣緩沖液2μl，用1.5%瓊脂凝膠在82伏特的電壓下電泳30 min。

2.3 結(jié)果判定 結(jié)果進行凝膠圖像吸光度分析，掃描定量分析DNA帶的含量，以所測得的積分吸光度與內(nèi)參照β-actin積分吸光度的比值代表半定量值。實驗重復(fù)3次，取其平均值進行統(tǒng)計分析。比較腫瘤組織、瘤旁組織及正常組織中表達差異。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料用以表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系用檢驗獨立樣本t檢驗，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

結(jié) 果

一、PPARγ、PTEN、Akt mRNA在胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中的表達

PPARγ、PTEN及Akt mRNA經(jīng)RT-PCR擴增后，擴增產(chǎn)物長度分別是163 bp、280 bp和217 bp，內(nèi)參β-actin的擴增產(chǎn)物為418 bp，見圖1。胃癌組織中PPARγ及Akt mRNA表達水平高于癌旁組織及正常胃組織（P＜0.05），而PTEN mRNA表達水平明顯較癌旁組織及正常胃組織低（P＜0.05），在癌旁組織與正常胃組織間PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達水平均無明顯差異（P＞0.05），見表2。

圖1 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達（RT-PCR）

表2 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達

表2 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達

注：與正常胃組織比較，a P＜0.05，F(xiàn) PPARγmRNA=59.029，F(xiàn) PTEN mRNA=24.127，F(xiàn) Akt mRNA=33.173；與癌旁組織比較，b P＜0.05，F(xiàn) PPARγmRNA=36.679，F(xiàn) PTEN mRNA=14.036，F(xiàn) Akt mRNA=9.251；與正常胃組織比較，c P＞0.05，F(xiàn) PPARγmRNA =1.345，F(xiàn) PTEN mRNA=2.798，F(xiàn) Akt mRNA=0.426

組 別 PPARγ mRNA PTEN mRNA Akt mRNA正常胃組織0.58±0.15 1.03±0.25 0.42±0.16癌旁組織 0.72±0.13c 0.87±0.17c 0.50±0.18c胃癌組織 1.51±0.35ab 0.46±0.14ab 1.03±0.31 ab

二、胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達與臨床病理因素的關(guān)系

胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性（P＞0.05），而與胃癌的TNM 分期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），見表3。

三、胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達的相互關(guān)系

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析表明，PPARγmRNA與PTEN mRNA表達呈負相關(guān)（rs=-0.492，P＜0.05），與Akt mRNA表達呈正相關(guān) （rs=0.623，P＜0.05），PTEN mRNA與Akt mRNA表達呈負相關(guān)（rs=-0.565，P＜0.05）。

表3 胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達與臨床病理因素的關(guān)系

續(xù)表

討 論

胃癌的發(fā)生可能與遺傳、環(huán)境及飲食等多種因素有關(guān)，現(xiàn)有治療方法如手術(shù)、放射治療、化學治療效果均不理想，根除Hp及抗氧化劑治療是否對降低或預(yù)防胃癌的發(fā)生具有真正價值還在進一步探討[6］。因此胃癌的發(fā)病機制和早期預(yù)防一直是消化道腫瘤研究熱點。

PPARγ是Ⅱ型核激素受體超家族成員，廣泛分布于全身許多組織如腎臟、肝臟、胃腸道、胰腺、乳腺、脾臟等，在內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和腫瘤細胞亦有表達。在被配體激活后，與類維生素A類受體結(jié)合形成異二聚體，再與靶基因啟動子區(qū)的特異性DNA序列稱為過氧化體增殖反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，其生物學效應(yīng)包括調(diào)控脂肪代謝和糖代謝，參與能量儲存和利用，控制單核細胞激活及誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡、抗炎癥反應(yīng)功能及抗動脈粥樣硬化等作用[7］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)PPARγ與多種消化道腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2-3］。我們的前期動物實驗證明，PPARγ配體羅格列酮能顯著降低化學致癌劑N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍誘導(dǎo)的大鼠腺胃癌發(fā)生率[4］。同時體內(nèi)研究顯示，PPARγ2外顯子B第12密碼子的CCA-GCA的錯義突變所致的Pro12Ala基因多態(tài)性與我國漢族人群胃癌的發(fā)生有關(guān)，增加Hp感染后胃癌發(fā)生的危險性[5］。為進一步了解PPARγ與胃癌之間的關(guān)系，我們檢測了胃癌患者的PPARγ mRNA表達情況，結(jié)果顯示，與正常胃組織及癌旁組織相比，胃癌組織中PPARγ呈高表達，與李強等[8］的研究結(jié)果一致，進一步證實PPARγ與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

PPARγ與腫瘤發(fā)生相關(guān)業(yè)已明確，但其中的作用機制尚不清楚。目前的研究熱點主要集中在PPARγ配體抗腫瘤作用方面，認為其可抑制腫瘤細胞增殖，促進分化并誘導(dǎo)凋亡，抑制血管生成[9］。然而也有研究認為PPARγ配體抗腫瘤作用并不是通過PPARγ途徑起作用的[10］。

PTEN-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是關(guān)鍵的細胞增殖相關(guān)信號通道之一。抑癌基因PTEN通過第二信使PI3K抑制Akt磷酸化活化，促進細胞色素C從線粒體的釋放及Caspases-9和Caspase-3的激活，從而抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，因此，PTEN-PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11］。薛鵬等[12］的研究結(jié)果顯示，胃癌組織中PTEN和磷酸化AKT蛋白的陽性表達率均高于相應(yīng)癌旁組織。近年來研究表明，PPARγ與PTEN-PI3K-Akt信號軸之間也存在聯(lián)系，PPARγ配體可通過上調(diào)PTEN表達，抑制PI3K/Akt信號軸，從而起到抑制細胞增殖，促進細胞凋亡等抗炎癥、抗腫瘤作用[13-14］。因此，本研究中我們檢測了PPARγ及PTEN、Akt在胃癌患者及正常人群體內(nèi)表達情況，結(jié)果表明，與正常胃組織及癌旁組織相比，胃癌組織中PPARγ及Akt mRNA水平明顯升高，而PTEN表達水平相應(yīng)下降，三者之間存在相關(guān)性。進一步結(jié)合胃癌患者的臨床病理特征分析，結(jié)果顯示，胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性，而與胃癌的TNM分期、侵犯漿膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

PTEN-PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又是如何參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展？新近研究表明，Akt可通過下游調(diào)控因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）這一信號通路，調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的活性，促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，進而促進腫瘤發(fā)展和新生血管形成[15］。目前我們正在檢測胃癌患者腫瘤組織中的p-mTOR、HIF-1和VEGF的表達，從而進一步探討PTEN-PI3K-Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌發(fā)病機制中的作用。

綜上所述，PPARγ、Akt的高表達及PTEN低表達與胃癌的生物學行為密切相關(guān)，并且三者相互關(guān)聯(lián)。聯(lián)合檢測PPARγ、PTEN、Akt，可能有助于對胃癌惡性程度的判定及侵襲轉(zhuǎn)移能力的評估，進而為胃癌的預(yù)后分析和進一步治療提供參考依據(jù)和新的靶點。

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