異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合自體PRP促進(jìn)皮膚慢性潰瘍創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究

王和庚 黎洪棉 田舉 趙培冉 梁雙武

皮膚慢性潰瘍?cè)谂R床上極為常見(jiàn)。老年患者一般情況差，基礎(chǔ)疾病多，細(xì)胞增殖和再生受限，創(chuàng)面修復(fù)和治療較為棘手。組織工程化人工皮膚的構(gòu)建和應(yīng)用為臨床大面積皮膚缺損的修復(fù)治療提供了新的途徑和方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）是一種具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，來(lái)源豐富，分離培養(yǎng)容易，已成為組織工程研究中常用的種子細(xì)胞[1-4］。近年的研究表明其對(duì)心、肺、皮膚、肌肉等組織創(chuàng)傷具有促進(jìn)愈合和功能修復(fù)的作用[5-6］。富血小板血漿（PRP）是通過(guò)離心分離自體全血而得到的血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長(zhǎng)因子，刺激細(xì)胞增殖分化并促進(jìn)軟組織的修復(fù)[6］。本研究在前期對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與細(xì)胞標(biāo)記等研究基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)異體BMSC，并與自體PRP聯(lián)合應(yīng)用于皮膚慢性潰瘍的治療，以觀察兩者是否有協(xié)同作用[7］。

材料與方法

一、材料和試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD大鼠17只，6～8周齡，體質(zhì)量約150 g，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。

2.主要試劑及儀器

包括DMEM、胎牛血清（美國(guó)Gibco），地塞米松、胰島素、吲哚美辛、胰蛋白酶、茜素紅、油紅O、DiI、二甲亞砜、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、阿爾辛藍(lán)、羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠IgG-cy3（美國(guó)Sigma），CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)HERABUS），兔抗鼠CD29、CD44抗體（武漢博士德），外科用凍干人纖維蛋白原及溶解液、外科用凍干人凝血酶（華蘭生物）。

二、方 法

1.BMSC的分離、培養(yǎng)、傳代與鑒定

取1只SD大鼠，行頸椎脫位法處死，于無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨，去除股骨雙側(cè)干骺端，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，以Ficoll液低速離心5 min，收集并計(jì)數(shù)有核細(xì)胞，加入等量含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM，稀釋后接種于75 ml培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，5 d后半量換液，以后每3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后消化傳代，以此獲得大鼠BMSC，采用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BMSC生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底70%～80%面積時(shí)，改用向脂肪細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1μmmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，200μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX）定向誘導(dǎo)，期間每2～3 d更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)至第6 d后按半量換液，定向分化誘導(dǎo)2周后進(jìn)行油紅O染色定性觀察體外誘導(dǎo)分化的結(jié)果。另取第3代BMSC接種培養(yǎng)，生長(zhǎng)至瓶底70% ～80%面積時(shí)，改用向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、0.1μmmol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸和10 mmol/L的β-磷酸甘油）定向誘導(dǎo)，3周后行茜素紅染色定性觀察誘導(dǎo)結(jié)果。另取第3代人BMSC培養(yǎng)生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底100%面積時(shí)改用向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10μg/L TGF-β1、6.25 mg/L胰島素、6.25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、50μmol/L抗壞血酸-2-磷酸酯）定向誘導(dǎo)，每2 d更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，定向誘導(dǎo)14 d后行阿爾辛藍(lán)染色，定性觀察誘導(dǎo)分化結(jié)果。取第3代ADSC爬片行CD29、CD44的免疫細(xì)胞熒光染色，并計(jì)算CD分子表達(dá)呈陽(yáng)性的細(xì)胞比例。

2.DiI標(biāo)記BMSC

參照說(shuō)明書(shū)的方法，將收集細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、離心2次，加入無(wú)血清DMEM制成細(xì)胞懸液，以109/L密度加入5μl的DiI溶液，37℃下孵育25 min，1 200 r/min離心5 min，PBS清洗、離心2次，加入上述完全培養(yǎng)基中，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞顯色情況，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，所得BMSC用于移植。

3.PRP的分離、提取

抽取同一只SD大鼠的全血10 ml，枸櫞酸二鈉抗凝，采用改良的Appel法分離、提取PRP備用，同時(shí)進(jìn)行全血及PRP血小板計(jì)數(shù)，以確保PRP中血小板的數(shù)量是全血的4倍以上[7］。

4.大鼠創(chuàng)傷模型制作及治療干預(yù)

取16只SD大鼠，以30 mg/kg戊巴比妥麻醉，在其背部脊柱一側(cè)旁距2 cm左上方處，利刀全層切除皮膚，形成一個(gè)直徑2 cm、面積24 cm2的圓形全層皮膚切除創(chuàng)面（A組）。同法在左下方（B組）、右上方（C組）及右下方（D組）各對(duì)稱部位皮膚作同樣大小的創(chuàng)面。創(chuàng)面暴露2周后進(jìn)行治療，凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面。將標(biāo)記好的5×106個(gè)BMSC制成細(xì)胞懸液，自體PRP制成凝膠狀，各組治療方案為：A組為局部注射異體BMSC懸液+PRP，B組為局部注射單純異體BMSC懸液；C組為局部注射單純PRP；D為局部注射等量生理鹽水。7、14 d頸椎脫位法各處死8只小鼠，采集標(biāo)本觀察結(jié)果。采用大體觀察、觀察傷口的生長(zhǎng)情況、傷口滲出量、損傷處的炎癥反應(yīng)；取得標(biāo)本后，以10%甲醛固定，蘇木素-伊紅染色及免疫組織熒光染色觀察創(chuàng)面愈合情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。計(jì)量資料以s表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、形態(tài)學(xué)及多向誘導(dǎo)分化

細(xì)胞約24～48 h貼壁，初為淋巴細(xì)胞樣小圓細(xì)胞，24～48 h后貼壁細(xì)胞明顯增多，并開(kāi)始分裂增殖，圓形細(xì)胞變形伸出偽足，約7 d長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底面積的70% ～80%，此時(shí)細(xì)胞逐漸融合成單層，細(xì)胞形態(tài)為梭形、多角形，呈集落狀生長(zhǎng)，并出現(xiàn)核分裂相。細(xì)胞圍繞集落中央呈島狀分布，并分泌大量基質(zhì)。傳代后的細(xì)胞形態(tài)與原代相似，以梭形為主，但生長(zhǎng)增殖較快。隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)均一、排列更有序的成纖維細(xì)胞樣（圖1A）。第3代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14 d，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有透亮的脂滴形成，油紅O染色可見(jiàn)脂滴被染成鮮紅色（圖1B）；成骨誘導(dǎo)3周，可見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)樣改變，茜素紅染色結(jié)節(jié)呈紅色（圖1C）；成軟骨誘導(dǎo)2周后，可見(jiàn)高度聚集生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，呈斑片狀或結(jié)節(jié)狀，周圍細(xì)胞呈放射狀，阿利辛藍(lán)染色提示結(jié)節(jié)及周邊聚集的細(xì)胞呈藍(lán)色（圖1D）。

圖1 第3代大鼠BMSC形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

二、Dil標(biāo)記及免疫熒光染色

DiI標(biāo)記后行臺(tái)盼藍(lán)染色，見(jiàn)BMSC活力好，僅偶見(jiàn)藍(lán)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，見(jiàn)全部BMSC標(biāo)記后胞漿及胞膜均顯紅色熒光（圖2A）。所標(biāo)記的BMSC呈梭形，胞漿豐富，保持了良好的正常形態(tài)，DiI標(biāo)記陽(yáng)性率為100%。DiI標(biāo)記后早期細(xì)胞形態(tài)呈熒光環(huán)狀，48 h后細(xì)胞中熒光顆粒增多，熒光增強(qiáng)，細(xì)胞標(biāo)記后7 d內(nèi)未見(jiàn)熒光明顯減弱，但細(xì)胞核未染熒光。標(biāo)記前、后的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。第3代BMSC行免疫熒光染色結(jié)果表明，CD29和CD44免疫熒光染色呈陽(yáng)性（圖2B、C）。

圖2 第3代大鼠BMSC DiI標(biāo)記及CD29和CD44免疫熒光染色結(jié)果

三、大體觀察

16只SD大鼠均單籠飼養(yǎng)，進(jìn)食正常，全部存活。治療7 d后，大鼠體質(zhì)量（150±1）g，與術(shù)前體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。14 d時(shí)，小鼠體質(zhì)量（159.05±1.89）g，比手術(shù)前有明顯增長(zhǎng)（t=12.728，P＜0.001）。在治療后7 d采集標(biāo)本時(shí)，4組創(chuàng)面均已完全愈合，但愈合創(chuàng)面均低于周圍正常皮膚，凹面程度不同，光滑不一。治療14 d后，A組創(chuàng)面與周邊組織連接程度較對(duì)照組緊密。B組和C組與周邊組織有一定的連接，而D組尚有凹面。

四、組織學(xué)觀察

治療7 d后，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，移植物與深筋膜貼近而存在。隨植入治療后時(shí)間的延長(zhǎng)，在移植物與深筋膜之間，可見(jiàn)到由大量呈較大橢圓核、常染色質(zhì)、著色淡、核仁清楚、Ⅰ型膠原陽(yáng)性的、功能活躍的成纖維細(xì)胞，豐富的血管以及大量粗細(xì)不一的膠原纖維束等組成的新生真皮結(jié)締組織。治療14 d后真皮結(jié)締組織更明顯。A、B、C組不同時(shí)間點(diǎn)的新生真皮組織，均明顯厚于D組，3組中功能旺盛的成纖維細(xì)胞，特別是I型膠原陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞、血管及膠原纖維均明顯多于D組。在A、B、C 3組中則以A組新生真皮組織最厚，見(jiàn)圖3。

圖3 治療7、14 d后各組創(chuàng)面病理組織學(xué)切片（蘇木素-伊紅染色，×200）

五、免疫熒光染色

治療后7、14 d組織切片A、B組免疫熒光染色均可見(jiàn)DiI染色陽(yáng)性的細(xì)胞，胞膜呈紅色熒光，標(biāo)記的BMSC在創(chuàng)面邊緣和創(chuàng)傷局部聚集，而C、D組未見(jiàn)有BMSC在創(chuàng)面邊緣和創(chuàng)傷局部聚集，見(jiàn)圖4。

圖4 治療7、14 d后各組創(chuàng)面免疫熒光染色結(jié)果（DiI染色，×100）

討 論

隨著我國(guó)工業(yè)化的不斷發(fā)展以及社會(huì)人口老齡化，各種原因造成的皮膚和軟組織慢性潰瘍等難愈性創(chuàng)面逐年增多。這類患者往往需要長(zhǎng)期住院、換藥，甚至經(jīng)過(guò)多次手術(shù)卻療效欠佳，不僅消耗了大量醫(yī)療資源，而且容易引發(fā)醫(yī)患糾紛，導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過(guò)程，呈現(xiàn)高度的整體性和網(wǎng)絡(luò)性。在機(jī)體的調(diào)控下，炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子等多因素相互協(xié)調(diào)，共同參與創(chuàng)面愈合。一般認(rèn)為創(chuàng)面修復(fù)緩慢甚至修復(fù)停止的原因主要有以下4種：①傷口感染或壞死組織存在；②傷口血供微循環(huán)障礙；③局部生長(zhǎng)因子數(shù)量減少，活性降低或多種生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失控；④修復(fù)細(xì)胞支架改變和過(guò)度凋亡，細(xì)胞膜上受體結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致生長(zhǎng)因子與受體之間失偶聯(lián)。移植補(bǔ)充新鮮的創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞和有活性的生長(zhǎng)因子是目前慢性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。BMSC是存在于骨髓組織中的一類成體干細(xì)胞，具有較低的免疫原性方便、易分離擴(kuò)增、可塑性強(qiáng)、離成熟細(xì)胞近等特點(diǎn)，是再生醫(yī)學(xué)中最有前途的種子細(xì)胞之一，特別是其跨胚層的分化潛能促使人們探討能否將BMSC進(jìn)行誘導(dǎo)分化以重建受創(chuàng)皮膚的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能。隨著對(duì)BMSC研究的深入，現(xiàn)已證實(shí)BMSC在損傷等刺激下能參與多種組織的修復(fù)作用，但其機(jī)制尚未完全闡明[8-11］。本研究觀察到，BMSC對(duì)創(chuàng)面愈合也有一定的促進(jìn)作用。識(shí)別外源性的BMSC，是干細(xì)胞體內(nèi)移植研究的重要環(huán)節(jié)。筆者通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，證明DiI標(biāo)記的陽(yáng)性率可達(dá)（98.5±2.2）%，可作為體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞所特有的標(biāo)記物以區(qū)分在體細(xì)胞。本研究在治療后7、14 d時(shí)，新生肉芽組織中均可見(jiàn)有帶DiI標(biāo)記的細(xì)胞分布，表明BMSC在損傷的皮膚組織內(nèi)能夠存活并能向周圍組織遷移。另外，本研究顯示經(jīng)BMSC治療后創(chuàng)面愈合速度提高，愈合質(zhì)量改善，創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞多，功能旺盛，血管密度大，治療組形成的新生表皮較厚，分層明顯。因此筆者認(rèn)為，局部創(chuàng)面應(yīng)用BMSC可以促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)并提高愈合質(zhì)量，與Satoh等[12-14］研究結(jié)果一致。

PRP是血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)軟組織的修復(fù)。由于PRP來(lái)源于自體，無(wú)免疫排斥，制作簡(jiǎn)單，不良反應(yīng)少，近年來(lái)國(guó)外已有應(yīng)用于牙周病、口腔種植、顱面及慢性潰瘍創(chuàng)面的研究報(bào)道。本研究顯示，單純的BMSC或單純的PRP對(duì)創(chuàng)面愈合也有一定的促進(jìn)作用，但效果不如兩者聯(lián)合應(yīng)用。其原因可能是，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，BMSC起到種子細(xì)胞的作用，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境的誘導(dǎo)作用下向組織細(xì)胞分化，而PRP則起到營(yíng)養(yǎng)的作用。同時(shí)，PRP中各種高濃度有活性的生長(zhǎng)因子可促進(jìn)BMSC的增殖分化，增加修復(fù)細(xì)胞數(shù)量，這些修復(fù)細(xì)胞通過(guò)旁分泌和自分泌形式分泌生長(zhǎng)因子又可以作用于周圍細(xì)胞及細(xì)胞自身，構(gòu)成了一個(gè)良性循環(huán)，兩者聯(lián)合起到協(xié)同修復(fù)的效果。然而，由于細(xì)胞存在于三維立體空間中，不同濃度的細(xì)胞，其細(xì)胞與細(xì)胞間的作用不同，對(duì)于BMSC參與組織修復(fù)可能是通過(guò)創(chuàng)傷的刺激以及局部創(chuàng)面的“壁龕”促進(jìn)BMSC趨化并誘導(dǎo)BAMSC向所需要的組織或細(xì)胞分化，其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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