菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠減毒作用的研究

廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248

菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠減毒作用的研究

黃紅坤王諾王弋黃小紅劉盛來(lái)孫俠林小婷任海濤鄺少松*

廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248

目的研究菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑治療S180荷瘤鼠效果及其減毒作用。方法建立S180荷瘤鼠模型10天后，將40只BALB/c小鼠按腫瘤體積隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、順鉑組、菲牛蛭提取物組、菲牛蛭提取物+順鉑組。分組后開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥7天，第8天處死各組小鼠，取血清檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)；取腎臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；剝離腫瘤稱(chēng)重計(jì)算抑瘤率。結(jié)果菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合使用具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(P<0.05)。與順鉑組比較，聯(lián)合用藥后菲牛蛭提取物可使S180荷瘤鼠的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA含量降低(P<0.05)。結(jié)論菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合使用治療S180荷瘤鼠具有相加作用，同時(shí)菲牛蛭提取物可減輕順鉑引起的肝腎毒性。

菲牛蛭；順鉑；S180；抗腫瘤

中藥水蛭資源具有可持續(xù)利用和發(fā)展的重要性[1]，而菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)，別名馬尼擬醫(yī)蛭，俗稱(chēng)金邊螞蟥，隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)、蛭綱、無(wú)吻蛭目、醫(yī)蛭科、牛蛭屬[2、3]，作為目前常見(jiàn)吸血類(lèi)水蛭中個(gè)體較大的品種，至今尚未被列入中國(guó)藥典?，F(xiàn)研究表明，菲牛蛭具有抗凝血、抗血栓、降血脂等藥理作用[4-7]，提示其有較好的臨床應(yīng)用前景[8]。水蛭、復(fù)方水蛭素具有體內(nèi)外抗腫瘤作用[9、10]，菲牛蛭及其提取物在抗腫瘤方面的研究較少，其對(duì)抗腫瘤藥物減毒作用方面亦未見(jiàn)報(bào)道。作為治療多種實(shí)體瘤一線(xiàn)抗腫瘤藥的順鉑，對(duì)腫瘤殺傷作用效果顯著，但毒副作用明顯，尤其是肝腎毒性[11]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑治療S180荷瘤鼠效果，以及其對(duì)順鉑減毒的作用。

1 材料

1.1 藥物 菲牛蛭提取物(批號(hào)：20120730；性狀：棕色干粉；含量：500ATU/g抗凝血酶活性單位，由南寧市科康生物技術(shù)有限公司提供)，為廣西菲牛蛭唾液提取物，用時(shí)用生理鹽水配制成0.3g/ml溶液。注射用順鉑(批號(hào)：2011026CF；性狀：黃色凍干粉末；齊魯制藥有限公司生產(chǎn))，用時(shí)用生理鹽水配制成0.5mg/ml溶液。

1.2 試劑及細(xì)胞株 總膽紅素(TBIL)試劑盒(釩酸鹽氧化法)(批號(hào)：20130816)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(液體)(紫外乳酸脫氫酶法)(批號(hào)：20130826)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(紫外-蘋(píng)果酸脫氫酶法)(批號(hào)：20131026)、尿素(BUN)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)(批號(hào)：20130526)、肌酐(CREA)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)(批號(hào)：20130712)、PBS緩沖液(批號(hào)：13090905)由廣州威佳科技有限公司提供；甲醛溶液(批號(hào)：130120，廣州市中南化學(xué)試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)(批號(hào)：20130512，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。肉瘤細(xì)胞S180，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供。

1.3 CKX41儀器倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；ACS電子天平，中山市衡新電子有限公司；0-150游標(biāo)卡尺，上海臺(tái)海工量具有限公司；日立7020型全自動(dòng)生化分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)有限公司。

1.4 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，50只，體重18～22g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：44007200004558。飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40%～70%，采用10h：14h晝夜間斷照明，喂以鼠專(zhuān)用全價(jià)顆粒飼料(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，自由進(jìn)食飲水。

2 方法

2.1 S180荷瘤鼠模型的建立 復(fù)蘇S-180小鼠腹水瘤細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS配成濃度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，對(duì)2只小鼠腹腔注射0.25ml細(xì)胞懸液，注射前用75%的酒精消毒小鼠腹部，且每次注射前需混勻細(xì)胞懸液。5d后，無(wú)菌抽取小鼠腹水，以PBS配成濃度為5.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將檢疫合格的BALB/c小鼠先剪去左前肢背部的被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左前肢背部皮下接種0.2ml的5.0×106個(gè)/ml的S-180腹水溶液，每次注射前需混勻腹水溶液。

2.2 動(dòng)物分組 造模10d后，將腫瘤生長(zhǎng)均勻且腫瘤體積約100mm3的40只雌性BALB/c小鼠按腫瘤體積隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、順鉑組、菲牛蛭提取物組、菲牛蛭提取物+順鉑組，每組10只。

2.3 給藥方式及取材 分組后各組小鼠開(kāi)始給藥。陰性對(duì)照組按20ml/kg體重灌胃給予生理鹽水；順鉑組按5mg/kg體重腹腔注射給予順鉑注射液；菲牛蛭提取物組按6g/kg體重灌胃給予菲牛蛭提取物藥液；菲牛蛭提取物+順鉑組按6g/kg體重灌胃給予菲牛蛭提取物藥液，同時(shí)按5mg/kg體重腹腔注射給予順鉑注射液。每天1次、連續(xù)給藥7d。

每2～3天測(cè)量2次腫瘤長(zhǎng)短徑；腫瘤體積按公式：V=1/2ab2測(cè)量計(jì)算，a、b分別表示長(zhǎng)和寬；計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)：針對(duì)每一種人癌異體移植瘤模型的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對(duì)照組RTV)。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為：RTV=Vt/V0。其中V0為分籠給藥時(shí)(即d0)測(cè)量所得腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

末次給藥后24h，取血后頸椎脫臼處死各組小鼠，取腎臟置于10%中性甲醛溶液(pH7.2～7.4)中固定，進(jìn)行H.E組織病理學(xué)檢查。剝離腫瘤稱(chēng)重并計(jì)算抑瘤率。將小鼠血清置于-80℃保存，用于檢測(cè)血清中ALT、AST、TBIL、CREA、BUN含量。

腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率(%)=(陰性對(duì)照組平均瘤重﹣治療組平均瘤重)/陰性對(duì)照組平均瘤重×100%。

2.4 菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng) 根據(jù)金正均公式[12]計(jì)算菲牛蛭提取物與順鉑聯(lián)合用藥效應(yīng)：兩藥合用抑制率：q值=[E(a+b)]/[Ea+Eb-Ea×Eb]。Ea、Eb：表示兩藥單用時(shí)各自的抑瘤率，q<0.85說(shuō)明兩藥合用有拮抗作用；q≥1.15說(shuō)明兩藥有協(xié)同作用；0.85

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析、Student-Newman-Keuls方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤體積的影響 表1顯示，與陰性對(duì)照比較，分組時(shí)各組小鼠腫瘤體積均勻。給藥第6、8d時(shí)，順鉑組及菲牛蛭提取物+順鉑組腫瘤體積明顯縮小(P<0.05)，菲牛蛭提取物組腫瘤體積有縮小趨勢(shì)。

表1 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤體積的影響±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1顯示，各組相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)不斷下降，以順鉑組和菲牛蛭提取物+順鉑組下降更顯著。

3.2 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對(duì)S180荷瘤鼠的腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響 表2顯示，與陰性對(duì)照組比較，順鉑組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，菲牛蛭提取物組腫瘤質(zhì)量下降，菲牛蛭提取物+順鉑聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量顯著下降(P<0.05)。

3.3 菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠的聯(lián)合效應(yīng) 根據(jù)金氏公式，以及各給藥組的抑瘤率計(jì)算。菲牛蛭提取物+順鉑組的聯(lián)合效應(yīng)如下：q值=0.7792/(0.8662+0.2869-0.8662×0.2869)=0.8614>0.85，說(shuō)明菲牛蛭提取物與順鉑具有相加作用。

表2 菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

注：表示與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.4 對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠血清中肝腎功能指標(biāo)的影響 表3顯示，與陰性對(duì)照組比較，順鉑組的ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量明顯升高(P<0.05)。與順鉑組比較，菲牛蛭提取物+順鉑組聯(lián)合用藥后可使S180荷瘤鼠ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量降低(P<0.05)。

3.5 菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠腎臟組織病理的影響 陰性對(duì)照組、菲牛蛭提取物組腎臟組織病理(HE染色)顯示其腎臟結(jié)構(gòu)正常，無(wú)病理變化。順鉑組10只小鼠均可見(jiàn)出現(xiàn)少量腎小管透明管型、蛋白管型；菲牛蛭提取物+順鉑組10只小鼠僅6例出現(xiàn)少量腎小管透明管型、蛋白管型，說(shuō)明聯(lián)合用藥后菲牛蛭提取物可減少腎臟透明管型的出現(xiàn)或使其出現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)。

表3 菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠血清肝腎功能指標(biāo)的影響±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；表示與順鉑組比較，#P<0.05。

4 討論

目前，惡性腫瘤已成為威脅人類(lèi)生命健康的疾病之一。在對(duì)惡性腫瘤的治療中，順鉑是目前最成功的化療藥物之一，其治療腫瘤種類(lèi)廣泛，具有很高的治愈率。但使其使用受限的因素有兩個(gè)：一是獲得性腫瘤耐藥性；二是順鉑嚴(yán)重的毒副作用，尤其是腎毒性[13]。因此在順鉑治療腫瘤的過(guò)程中，如何不影響甚至增強(qiáng)其療效的同時(shí)減輕其毒副作用是目前臨床面臨的問(wèn)題。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，水蛭具有抗腫瘤作用，對(duì)癌瘤生長(zhǎng)有抑制、破壞作用，水蛭還有抗高凝作用，有利于抗癌藥及免疫活性細(xì)胞侵入癌組織而殺傷癌細(xì)胞。本研究顯示，菲牛蛭提取物單獨(dú)使用對(duì)S180荷瘤鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的趨勢(shì)，與順鉑聯(lián)合用藥后，其抑瘤效果比單用菲牛蛭效果明顯。經(jīng)計(jì)算說(shuō)明菲牛蛭提取物與順鉑具有相加的抗腫瘤作用。另外，給藥7d后，順鉑組的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA肝腎功能指標(biāo)顯著升高，菲牛蛭提取物聯(lián)合順鉑用藥，小鼠各項(xiàng)肝腎功能指標(biāo)均明顯下降，提示順鉑對(duì)S180荷瘤鼠具有一定的肝腎毒性作用，而菲牛蛭提取物在一定程度上能夠拮抗順鉑對(duì)S180荷瘤鼠的肝腎毒副作用。而菲牛蛭提取物對(duì)順鉑治療S180荷瘤鼠減毒的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。在本研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭提取物并不能完全緩解由順鉑引起的小鼠體重減輕情況；另外順鉑毒副作用較廣，本研究?jī)H涉及其肝腎毒性方面，對(duì)其他毒性是否具有減輕作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究還進(jìn)行了菲牛蛭提取物急性毒性研究，采用最大給藥量法18g/kg體重劑量灌胃給予小鼠，觀(guān)察14d未見(jiàn)出現(xiàn)毒性表現(xiàn)，體重正常增長(zhǎng)。說(shuō)明菲牛蛭提取物本身毒性較低，綜合其藥理作用，繼續(xù)開(kāi)發(fā)利用菲牛蛭具有較高的應(yīng)用價(jià)值。由于菲牛蛭提取物為菲牛蛭唾液提取，屬于粗提物，唾液粗提物成分較廣，若能進(jìn)一步分離純化提取出其抗腫瘤成分及其減毒成分，對(duì)進(jìn)一步研究其抗腫瘤等作用具有重要意義。

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AttenuationeffectofmanillensisextractoncisplatininthetreatmentofmicebearingS180tumor

HUANG Hong-kun WANG Nuo WANG Yi HUANG Xiao-hong LIU Sheng-lai XUN Xia LIN Xiao-ting REN Hai-tao KUANG Shao-xiong*

Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Foshan 528248,China

ObjectiveManillensis extract combined with cisplatin in the treatment of mice bearing S180 tumor and attenuation effects.MethodS180 tumor-bearing mice model for 10 days,fourty BALB/c mice were randomly divided into negative tumor volume in the control group,cisplatin, manillensis extract group, manillensis extract+cisplatin group.After the group began to administration, continuous.administration for 7 days, 10 mice in each group were sacrificed on eighth day, the serum to detect indicators of liver and kidney function; taken for histopathological examination of kidney; peel the tumor weighed to calculate the inhibition rate.ResultsManillensis extract in combination with cisplatin inhibited tumor growth (P<0.05).compared with cisplatin,the combination therapy can extract manillensis ALT S180 tumor-bearing mice, AST, TBIL, BUN, CREA was decreased (P<0.05).ConclusionManillensis extract used in combination therapy with cisplatin S180 tumor-bearing mice have an additive effect, while manillensis extract kidney toxicant reduce cisplatin-induced.

manillensis; cisplatin; S180; anti-tumor effect

廣東省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(20121279)。

黃紅坤(1978-)，女，漢族，廣西靈山人，助理研究員，碩士學(xué)位，主要從事藥理學(xué)與毒理學(xué)研究工作。

鄺少松(1973-)，女，漢族，廣東佛山人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士學(xué)位，主要從事藥理學(xué)與毒理學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)室管理工作。

R285.5

A

1007-8517(2014)13-0012-03

2014.04.25)