正交試驗(yàn)法優(yōu)化苦豆子總生物堿的超聲提取工藝

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021

正交試驗(yàn)法優(yōu)化苦豆子總生物堿的超聲提取工藝

李軍郝彩琴馬小蘭王海霞王建建冷曉紅

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021

目的優(yōu)選苦豆子中總生物堿的超聲提取工藝。方法以總生物堿提取率為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)考察料液比、超聲溫度、乙醇濃度、超聲時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響，確定最佳提取工藝。結(jié)果各因素對(duì)超聲提取工藝的影響順序?yàn)槌暅囟?料液比>超聲時(shí)間>乙醇濃度; 最佳提取工藝為用65%乙醇，按料液比1:16，溫度30℃，超聲提取2次，每次20min。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高。

苦豆籽；總生物堿；正交試驗(yàn)；超聲提取

苦豆子(SophoraalopecuroidesL. ) 是寧夏地區(qū)重要的藥用植物資源，野生資源分布較廣[1]?？喽棺铀幱貌课粸榛ㄆ诘母稍锏厣喜糠址Q“苦豆草”及成熟的種子稱“苦豆籽”。含有苦參堿(Matrine)、氧化苦參堿(Oxymatrine)、槐果堿( Sophocarpine)、槐定堿( Sophridine)、苦豆堿(Aloperine)等20多種生物堿[2]，其中以槐定堿的含量最高[3]?？喽棺涌偵飰A不僅具有抗癌、抑癌、抑制和殺滅各種微生物的藥理活性，而且對(duì)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)有廣泛的藥理作用[4]。目前苦豆籽提取主要為超聲波、回流提取苦參堿[5、6]，以及微波法和傳統(tǒng)方法提取總生物堿[7]。鑒于超聲波在中藥成分提取中可縮短提取時(shí)間，提高效率[8]。且以苦參堿為指標(biāo)的提取不能完全反映總生物堿的提取率。因此，本研究以苦豆籽總生物堿的提取率為指標(biāo)，通過超聲波提取法進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)對(duì)影響總生物堿提取率的因素進(jìn)行優(yōu)化，選出最佳的提取工藝條件，為苦豆籽中總生物堿的提取及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 HT-600A型超聲波儀(天津東康科技有限公司)；TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；AE-240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；DKB-8A 電熱恒溫水槽(上海精宏儀器設(shè)備有限公司)；130-A 型高速粉碎機(jī)(長(zhǎng)沙市中南制藥機(jī)械廠)。

1.2 試藥 苦豆籽藥材(采于鹽池縣花馬池鎮(zhèn))，經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)種子；槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110784-200303，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。其余試劑均為分析純，水均為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿含量測(cè)定

苦豆籽總生物堿含20多種化合物，以槐定堿的含量最高，參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]采用溴麝香草酚藍(lán)比色法以槐定堿為指標(biāo)成分測(cè)定苦豆籽總生物堿含量(λ=410nm)。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱定槐定堿對(duì)照品5.01mg，置5ml容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得槐定堿對(duì)照液。取上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140μl，分別置于50 ml的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍(lán)pH=7.6緩沖液12ml、氯仿12ml，密塞劇烈振搖2min，靜置2h后分出氯仿層，以同法處理無槐定堿對(duì)照液為空白，于410nm處測(cè)定提取液的吸光度[8]，以吸光度為橫坐標(biāo)，氯仿層濃度為縱坐標(biāo)得回歸方程：A=0.0131C+0.0002，r=0.9999。

2.1.2 含量測(cè)定 分別吸取提取液1ml，稀釋至10ml，吸取0.2ml至錐形瓶中，加入溴麝香草酚藍(lán)pH =7.6緩沖液12ml，氯仿12ml，密塞振搖2min，靜置2h，分取氯仿層，以一定濃度的乙醇0.2ml，溴麝香草酚藍(lán)pH=7.6緩沖液12ml和氯仿12ml同比操作為空白，于410nm處測(cè)定提取液的吸光度，從制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的生物堿濃度，并算出苦豆籽總生物堿的提取率。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆籽提取液，按照“2.1.2”項(xiàng)的方法操作，平行測(cè)定6次吸光度值，6次測(cè)定結(jié)果的RSD為0.57%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆籽提取液，按“2.1.2”項(xiàng)的方法操作，每隔30min于410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，共測(cè)5次，5次結(jié)果的RSD 0.45%，表明樣品溶液在120min 內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次提取的苦豆籽提取物，按“2.1.2”項(xiàng)的方法平行制備6份供試品溶液，并測(cè)定吸光度，6次測(cè)定結(jié)果的RSD為1.13%，說明方法重復(fù)性較好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比 準(zhǔn)確稱取5份10.0g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，加入80、120、160、200、240 ml 55%乙醇，浸泡1h，超聲波處理20 min后，濾過，濾液作為提取液。按照“2.1.2”項(xiàng)的方法測(cè)定生物堿提取率。由圖1可知，當(dāng)溶劑用量達(dá)到1∶24 時(shí)，苦豆子中生物堿提取率最高，考慮工業(yè)化生產(chǎn)中料液比不宜過大。因此，選擇1∶16、1∶20、1∶24作為正交試驗(yàn)的3個(gè)考察水平。

圖1 料液比對(duì)提取率的影響

2.2.2 超聲提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取5份10.0g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，各加入160 ml 55%乙醇，浸泡1h，分別超聲處理10、20、30、40、50min后，濾過，濾液作為提取液。按照“2.1.2”項(xiàng)的方法測(cè)定生物堿提取率。由如圖2可知，在10～30min內(nèi)，苦豆籽總生物堿的提取率隨著超聲時(shí)間基本保持不變，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率有所下降。因此，選擇10，20，30min 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.3 超聲提取次數(shù) 準(zhǔn)確稱取1份10.0g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，各加入160 ml 55% 乙醇，浸泡1h，分別超聲提取1次、2次、3次、4次、5次(每次超聲20min)后，濾過，濾液作為提取液。按照“2.1.2”項(xiàng)的方法測(cè)定生物堿提取率。有圖3可知，隨著超聲提取次數(shù)的增加，提取率逐漸降低，其中第3次超聲提取的生物堿提取率只有0.09%，考慮生產(chǎn)成本和收率的關(guān)系，故選擇超聲提取2次。

圖3 超聲提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

2.2.4 超聲溫度 準(zhǔn)確稱取4份10.0g的苦豆籽粉, 分別置于三角瓶中，各加入160 ml 55%乙醇，20、40、60、 80℃浸泡1h，分別在20、40、60、80℃超聲20min后，濾過，濾渣繼續(xù)超聲1次，合并濾液作為提取液。按照“2.1.2”項(xiàng)的方法測(cè)定生物堿提取率。由圖4可知，苦豆籽總生物堿的提取率在40℃時(shí)最高。因此，選擇30、40、50℃ 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 超聲溫度對(duì)提取率的影響

2.2.5 溶劑濃度 準(zhǔn)確稱取4份10.0g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，加入160 ml45、55、65、75%的乙醇，浸泡1h，超聲處理2次，每次20min，合并濾液作為提取液。按照“2.1.2”的方法測(cè)定生物堿提取率。由圖5可知，苦豆籽總生物堿的提取率隨著溶劑濃度增加，提取率先增加后降低。因此，選擇45、55、65% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 溶劑濃度對(duì)提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱取9份苦豆籽粉，每份10.0g，以上述單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，確定溶劑濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度這四個(gè)因素做正交試驗(yàn)，采用L9 (34 ) 正交表(見表1)進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳的提取條件。由表2可知，四個(gè)因素對(duì)提取率的影響主次順序?yàn)锽> A> D >C。由表3的方差分析可知，四個(gè)因素對(duì)苦豆籽總生物堿提取率無顯著性影響，但溫度對(duì)生物堿提取率的影響較重要，其他因素影響較小。綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際過程及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳的提取工藝條件是：A1B1C3D2，即用65%乙醇，按料液比1∶16，溫度30℃，超聲提取2次，每次20min。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9 (34)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表(α=0.05)

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取3份10.0g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，各加入160 ml 65% 乙醇，30℃浸泡1h，超聲2次，每次20min，濾過，合并濾液作為提取液。按照“2.1.2”項(xiàng)的方法測(cè)定生物堿提取率。其提取率分別為4.55%、4.68%和4.59%，均值4.60%(RSD 1.45%)，高于正交試驗(yàn)中的最高值，表明該工藝切實(shí)可行。

3 討論

超聲波提取法在中藥成分提取中的應(yīng)用越來越廣，且用于生物堿的提取[10]，且具有節(jié)約時(shí)間、節(jié)省成本、提取率高、純度好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于能源消耗大、成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)的中藥規(guī)模生產(chǎn)有一定的應(yīng)用價(jià)值[11、12]。本試驗(yàn)以苦豆籽總生物堿的提取率為指標(biāo)，采用超聲提取苦豆籽總生物堿，可保證較高的提取效率且節(jié)約成本，為苦豆籽總生物堿的中試放大提供了工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

據(jù)報(bào)道，生物堿類成分的提取多用甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑或1%左右的酸水(硫酸或醋酸)[13]。甲醇由于有毒，且不環(huán)保，工業(yè)生產(chǎn)中使用很少，而乙醇提取比酸水提取徹底，雜質(zhì)少、提取時(shí)間短。故本試驗(yàn)選擇乙醇作為溶劑進(jìn)行超聲提取。

試驗(yàn)選擇了料液比、超聲時(shí)間、超聲提取次數(shù)、超聲提取溫度和溶劑濃度，尚有溶劑pH值、浸潤(rùn)時(shí)間、超聲功率等因素可供選擇。而在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶劑pH值、浸潤(rùn)時(shí)間和超聲功率對(duì)苦豆籽總生物堿的提取率影響很小，因此后續(xù)的試驗(yàn)中只選擇了試驗(yàn)的五個(gè)因素。其中超聲提取次數(shù)經(jīng)過單因素試驗(yàn)，超聲提取第2次的提取率為0.42%，第3次的提取率僅有0.09%，故選擇超聲提取2次，未將其作為正交因素之一。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，四個(gè)因素對(duì)苦豆籽總生物堿提取率無顯著性影響，但溫度對(duì)生物堿提取率的影響較重要，其他因素影響較小[14]。溫度不宜過高，可能是溫度太高會(huì)使生物堿的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，發(fā)生分解，且溫度太高，乙醇揮發(fā)嚴(yán)重，也會(huì)影響生物堿的提取[15]。另外，料液比對(duì)生物堿提取率的影響不大，可能是由于溶劑量的增大使其他成分的溶出率增大從而影響生物堿的溶出，導(dǎo)致提取率變化不大甚至下降[16]。正交試驗(yàn)為不完全組合性試驗(yàn)，對(duì)其優(yōu)選出的最佳工藝要進(jìn)行驗(yàn)證[17]，工藝驗(yàn)證結(jié)果顯示，優(yōu)選的工藝合理、可行，可用于苦豆籽總生物堿的提取工藝。

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OptimizationofUltrasonicExtractionProcessforTotalAlkaloidsfromSophoraAlopecuroidesL.byOrthogonalTest

Li Jun Hao Cai-qin Ma Xiao-lan Wang Hai-xia Leng Xiao-hong

Ningxia Collage of Vocation and Technology，Ningxia Engineering Technology Research Center of Chinese Herbs Development and Utilization, Yinchuan 750021,China

ObjectiveTo optimize ultrasonic extraction process of total alkaloids from Sophora Alopecuroides L.．MethodWith extraction rate of total alkaloids as index，effects of liquid-solid ratio，ultrasonic temperature, ethanol concentration，ultrasonic time, extraction times on extraction process were investigated by single factor test and orthogonal test.ResultThe influencing order of each factors on ultrasonic extraction process of total alkaloids was ultrasonic temperature>liquid-solid ratio>extraction time>ethanol concentration. Optimum extraction process was as following: ultrasonic extracted 2 times with 16 times the amount of 65% ethanol, 20 min one time, ultrasonic temperature 30℃.ConclusionsThis optimized process was stable and feasible with high extraction rate．

Sophora Alopecuroides L.，Total alkaloids, Orthogonal design, Ultrasonic extraction

R284.2

A

1007-8517(2014)08-0024-03

2014.02.10)