中藥雞骨草和毛雞骨草的HPLC指紋圖譜研究

西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710126

中藥雞骨草和毛雞骨草的HPLC指紋圖譜研究

曾琦齊元博薛錦文王俊影聶發(fā)玉張象涵

西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710126

目的建立雞骨草和毛雞骨草兩種藥材的化學(xué)指紋圖譜。方法采用HPLC高效液相色譜法，色譜柱Inertsil ODS-SP C18(4.6×250mm，5μm)，水-甲醇10%～100 %梯度洗脫40min，流速1.0mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm。結(jié)果分別建立了雞骨草和毛雞骨草的指紋圖譜，顯示出特征峰。結(jié)論HPLC指紋圖譜中各峰分離度較好，方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為雞骨草和毛雞骨草的化學(xué)有效成分的異同及替代安全性問題研究提供參考。

雞骨草；毛雞骨草；指紋圖譜；HPLC

雞骨草是豆科相思子屬植物廣州相思子 (Abrus cantoniensis Hance) 的干燥全草，是一種常用中藥材[1]。具有清熱解毒、利濕、活血化瘀、舒肝止痛等功效，可用于急慢性肝炎、肝硬化腹水、膽囊炎、胃痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷、乳腺炎、泌尿系統(tǒng)感染等病癥[2]，為廣東涼茶成分之一[3]，也是治療肝炎良藥“雞骨草膠囊”的主要原料[4]。毛雞骨草為雙子葉植物藥豆科植物毛相思子 (Abrus mollis Hance)的全株。具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，健胃消積的功效，用于傳染性肝炎、小兒疳積；外用可治療燒傷、燙傷、瘡癤[5]。我國的雞骨草資源十分豐富，且雞骨草相關(guān)品種已在臨床大量使用。在2010版《中華人民共和國藥典》中，只有廣東相思子被定為雞骨草的基源植物，民間卻一直將雞骨草與毛雞骨草混用。本研究分別建立了雞骨草和毛雞骨草的指紋圖譜，為這兩種藥用植物在化學(xué)有效成分的異同及替代安全性問題研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU高效液相色譜儀(日本島津公司，LC-20AT泵，Inertsil ODS-SP C18 4.6×250mm，5μm色譜柱，SPD-M20A檢測器，LCsolution工作站)；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；萬能粉碎機(jī)；JA2603B電子天平。

1.2 試藥 雞骨草(采自廣東省梅州市)；毛雞骨草(采自廣西省貴港地區(qū)山上)。甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的提取 分別取雞骨草和毛雞骨草兩種藥材的細(xì)粉末，精密稱定10.0g，置于錐形瓶中，加入分析純的甲醇60ml，浸泡5d。用分析濾紙過濾得到濾液，后旋干得到提取物備用。

2.2 藥材溶液的制備 分別精密稱取兩種藥物的提取物50mg，完全溶于色譜純的甲醇1ml，得到50mg/ml的母液；將母液依次稀釋得到濃度為5、0.5、0.05mg/ml的溶液；將所有溶液用0.22μm的濾膜過濾，得到濾液作為供試溶液。

2.3 藥材濃度的選擇 配置好的0.05、5 、50 mg/ml以及更濃的未定濃度的雞骨草供試液來探索適宜藥物濃度，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果顯示當(dāng)供試液濃度為0.05 mg/ml時，基線漂移嚴(yán)重，無特征峰；濃度為50 mg/ml的供試液，可以獲得最大吸光度。且濃度為50mg/ml的毛雞骨草也顯示較強(qiáng)的吸光度，故選定濃度為50mg/ml的藥物進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.4 藥材進(jìn)樣量的選擇 精密吸取50mg/ml的雞骨草8、10、15 μl注入高效液相色譜儀，結(jié)果顯示8μl的進(jìn)藥量出現(xiàn)基線漂移問題；15μl的進(jìn)樣量產(chǎn)生過載現(xiàn)象出現(xiàn)平頭峰；而10μl的進(jìn)樣量不僅能降低基線漂移，還使最大吸收峰完整。因此，選用10μl的進(jìn)樣量。

2.5 色譜條件的確定

2.5.1 梯度洗脫與等度洗脫的選擇[6]在高效液相色譜儀的流速1.0ml/min，紫外檢測波長280nm，柱溫25℃，記錄時間30 min不變的情況下，分別進(jìn)行下列試驗：①甲醇-水等度洗脫，0～20min (30%～30%), 20～30min(100%～100%)；②甲醇-水等度洗脫，0～20 min (45%～45%), 20～30 min(100%～100%)；③甲醇-水等度洗脫，0～20 min (60%～60%)，20～30 min(100%～100%)；④甲醇-水等度洗脫，0～20 min (80%～80%)，20～30 min(100%～100%)；⑤甲醇-水梯度洗脫，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)。

用甲醇分別進(jìn)行30%、45%、60%、80%一系列等度洗脫，結(jié)果并沒有分離出理想峰值，圖譜不穩(wěn)定，且基線漂移問題較嚴(yán)重。故用等度洗脫不能很好地保證實驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，而用梯度洗脫可以保證較好的分離度和穩(wěn)定性。

2.5.2 流動相為甲醇和乙腈的選擇 ①甲醇-水梯度洗脫，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)；②乙腈-水梯度洗脫，0～20 min(10%～100%)，20～30 min (100%～100%)。果表明用乙腈梯度洗脫時波動性較大，而用甲醇梯度洗脫時峰形及穩(wěn)定性更好，有利于分析。

2.5.3 儀器可靠性檢測 ① 將1 mg/ml的醋酸潑尼松龍母液進(jìn)樣10μl，用60%甲醇等度洗脫20min，柱溫25℃，池溫40℃，泵壓穩(wěn)定在20MPa。② 將1mg/ml的醋酸潑尼松龍母液進(jìn)樣10μl，用60%甲醇等度洗脫20min，柱溫40℃，池溫40℃，泵壓穩(wěn)定在16MPa。結(jié)果在254 nm處檢測吸收峰，出現(xiàn)穩(wěn)定的單峰。而且柱溫改變，只是使出峰時間有差異，并無吸光度的影響。

2.5.4 色譜條件的確定 甲醇-水梯度洗脫，0～40min (10%～100%)，40～50min(100%～100%)，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，記錄時間50 min。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗[7]取毛雞骨草溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜比對如圖1所示，計算相對峰面積和相對保留時間的RSD，結(jié)果RSD< 3%，表明儀器精密度良好。

圖1 毛雞骨草溶液連續(xù)5次進(jìn)樣的HPLC指紋圖譜

圖2 雞骨草和毛雞骨草的HPLC指紋圖譜

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 取毛雞骨草溶液，分別在0、4、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)樣測定，結(jié)果RSD<3%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗 取毛雞骨草溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜導(dǎo)人中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)處理，所得指紋圖譜的相似度均>90 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 空白試驗 吸取空白溶劑甲醇10μl進(jìn)樣，結(jié)果表明空白溶劑對藥材指紋圖譜中色譜峰的檢出無干擾。

2.7 指紋圖譜的建立與分析

2.7.1 圖譜的獲得 分別精密吸取雞骨草和毛雞骨草溶液10μL，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

2.7.2 指紋圖譜的分析與相似度評價 對比指紋圖譜可以發(fā)現(xiàn)，兩種藥材所含化學(xué)成分的數(shù)與量存在差異。其中雞骨草的極性段成分突出，集中在中高極性段(如圖2所示)，且主成分的相對含量突出；而毛雞骨草的成分含量趨向均一化，不易準(zhǔn)確分析判斷其主成分。通過指紋圖譜相似度計算軟件對兩種藥材進(jìn)行相似度評價，得到雞骨草和毛雞骨草的最大相似度為0.52。

3 結(jié)論

本實驗考察了分別以0.05、5、50mg/ml及更大濃度的雞骨草提取液進(jìn)樣，結(jié)果在50mg/ml的濃度時得到最大吸光度。在色譜條件摸索過程中，分別用甲醇-水的等度洗脫、甲醇-水的梯度洗脫和乙腈-水的梯度洗脫方法，對結(jié)果穩(wěn)定性和分離度的綜合考慮，發(fā)現(xiàn)甲醇-水梯度洗脫的效果最好。

通過對雞骨草和毛雞骨草的幾種HPLC方法進(jìn)行比較，表明雞骨草和毛雞骨草在關(guān)鍵部位有相同的色譜特征峰，說明兩種藥材存在相同的化學(xué)成分，為相互替代提供了依據(jù)。但雞骨草的主成分較突出，而毛雞骨草的成分更均一化，因此在藥效學(xué)方面值得關(guān)注。

中藥復(fù)方成分極為復(fù)雜，僅僅使用定性鑒別和指標(biāo)成分的含量測定方法很難準(zhǔn)確的判斷其內(nèi)在的質(zhì)量，更不用說找出其中引起藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)；而對其進(jìn)行指紋圖譜測定，可提供多成分群的特征。本研究建立的兩種藥材的HPLC指紋圖譜，各峰分離度較好，方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為雞骨草和毛雞骨草的化學(xué)有效成分的異同及替代安全性問題研究提供參考。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：180．

[2]《中華本草》編委會．中華本草[M]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：303．

[3]劉傳明．雞骨草的種類與鑒別[J]．時珍國醫(yī)國藥，2004，15(11)：767．

[4]黃榮韶，羅永明，胡彥，等．毛雞骨草總皂苷含量測定及其動態(tài)變化研究[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，42(6)：28．

[5]中國藥科大學(xué)．中藥辭海 [M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998：1114．

[6]史海明，黃志勤，溫晶晶，等．HPLC法測定雞骨草藥材中相思子堿的含量[J]．藥物分析雜志，2007，27(11)：1716-1718．

[7]黃勇斌，孫毅東，李耿，等．雞骨草藥材指紋圖譜研究[J]．今日藥學(xué)雜志，2011，21(5)：280-282．

ResearchonHPLCFingerprintofAbrusCantoniensisandAbrusMollis

ZENG Qi,QI Yuan-bo,XUE Jin-wen,WANG Jun-ying,NIE Fa-yu,ZHANG Xiang-han

School of Life Science and Technology,Xidian University,Xi’an 710126,China

ObjectiveTo establish a HPLC fingerprint analysis method for Abrus cantoniensis and Abrus Mollis．MethodsInertsil ODS-SP column(250mm×4.6mm,5μm)was used，with gradient elution by the mobile phase consisted of water-Methanol 10-100%.The flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelength was 210 nm．ResultsThe offingerprint of A. cantoniensis and A. Mollis were established，which show some common peaks between them.ConclusionThe characteristic peaks are selected with good resolution，and the method is accurate and stable．It can be used for the study of the similarities and differences of chemical active ingredients between A. cantoniensis and A. Mollis．

Abrus cantoniensis；Abrus Mollis ;fingerprint chromatogram；HPLC

2013年陜西省自然科學(xué)基金(2013JQ4040)及西安電子科技大學(xué)新實驗開發(fā)與新實驗設(shè)備及實驗教學(xué)改革項目的資助(項目編號：SY1247)。

曾琦(1985-)，女，講師，博士，主要從事天然藥物化學(xué)及分析化學(xué)的研究工作。E-mail：qzeng@xidian.edu.cn

R286.0

A

1007-8517(2014)14-0022-03

2014.05.26)