苗醫(yī)推拿對緩解期哮喘兒童IFN-γ、IL-4、IL-17的影響及表觀遺傳學(xué)機制

中正

1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000;2.吉首大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院2012級統(tǒng)計學(xué)研究生,湖南 吉首 416000

苗醫(yī)推拿對緩解期哮喘兒童IFN-γ、IL-4、IL-17的影響及表觀遺傳學(xué)機制

石維坤1李艷2李中正1

1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000;2.吉首大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院2012級統(tǒng)計學(xué)研究生,湖南 吉首 416000

目的觀察苗醫(yī)推拿治療緩解期兒童哮喘的臨床療效及對免疫平衡的影響，并初步探討其表觀遺傳學(xué)機制。方法30例健康兒童為健康對照組。30例哮喘緩解期兒童為推拿組，比較推拿前后兒童哮喘控制測試(C-ACT)評分，檢測血清Th1、Th2及Th17的代表性細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量及外周血CD4+T細胞的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)及組蛋白去乙?；?HDAC)的活性。結(jié)果苗醫(yī)推拿總有效率達93.34%，可升高血清IFN-γ水平，同時降低IL-4及IL-17水平，并抑制HAT活性，同時增強HDAC活性(均P<0.05)。結(jié)論苗醫(yī)推拿治療緩解期兒童哮喘療效肯定，能有效調(diào)節(jié)免疫平衡。組蛋白乙?；揎椀缺碛^遺傳學(xué)機制可能在其中發(fā)揮了一定作用。

湘西劉氏小兒推拿；哮喘；IFN-γ；IL-4；IL-17；表觀遺傳學(xué)

兒童支氣管哮喘是目前臨床常見的慢性呼吸道疾病，有反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的特點[1]。經(jīng)典理論認(rèn)為Th1型免疫反應(yīng)減弱而Th2型免疫反應(yīng)異常增強在哮喘的發(fā)病過程中起到重要作用，即Th1/Th2細胞失衡學(xué)說[2-3]；近年來發(fā)現(xiàn)Th17細胞/Treg(調(diào)節(jié)性T細胞)的免疫失衡也是哮喘發(fā)病的重要機制之一[4]。我國已故著名推拿大師劉開運教授開創(chuàng)了獨具特色的苗醫(yī)“小兒推拿”[5]，稱為湘西劉氏小兒推拿流派，治療小兒肺、脾系疾病療效最為顯著[6]。本研究對比治療前后血清Th1、Th2及Th17的代表性細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量，觀察苗醫(yī)推拿對緩解期哮喘兒童免疫平衡的影響；并通過檢測外周血CD4+T細胞的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)及組蛋白去乙?；?HDAC)的活性，初步探討其表觀遺傳學(xué)機制。本研究得到了吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查和批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20130002)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集吉首大學(xué)附屬中醫(yī)院(湘西土家族苗族自治州民族中醫(yī)院)門診病例30例，作為推拿組，其中男13例，女17例；土家族20例，苗族10例；年齡最小5歲，最大6歲半，平均6.45±1.18歲；病程最短6個月，最長4年，平均3.32±1.56年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡5至7歲，性別不限，民族不限；②符合緩解期兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；③除哮喘外無其他疾病；④患兒家長或監(jiān)護人簽署知情同意書。另從健康管理中心隨機收集30例健康兒童為健康對照組，要求年齡5至7歲，無過敏病史，近期無呼吸道感染史，近期未使用藥物；其中男11例，女19例；土家族18例，苗族12例；年齡最小5歲，最大7歲，平均6.74±1.48歲。2組兒童在性別、民族構(gòu)成、年齡等方面差異均無顯著性(P>0.05)。

1.2 治療方法 推拿組治法為：補益脾肺、固腎納氣?；純好嫦蜥t(yī)生站立，取其左側(cè)肢體施術(shù)，用姜汁作推拿介質(zhì)，具體推治如下：常例手法(開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次)。補腎經(jīng)400次，補肺經(jīng)350次，補脾經(jīng)300次，清肝經(jīng)250次，揉外勞宮100次，揉板門120次，揉按肺俞150次，捏脊5遍，推膻中120次，揉中脘、丹田各150次，揉按足三里120次，按肩井3次。

女童由女醫(yī)師進行推拿治療。每周治療3次(具體時間由兒童的監(jiān)護人決定)，共治療3個月。治療前后分別采集哮喘患兒晨起空腹靜脈血10ml。健康對照組兒童入組后也采集晨起空腹靜脈血10ml。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 兒童哮喘控制測試(C-ACT)[8]治療前后各評估一次。得分≥25分為哮喘臨床控制，20～24分為部分控制，<20分為未控制。

1.3.2 細胞因子含量檢測 IFN-γ、IL-4、IL-17試劑盒購自武漢博士德公司，酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek，ELX-800)，采用ELISA法檢測血清細胞因子的含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 HAT、HDAC活性檢測 淋巴細胞分離液購自上海研謹(jǐn)公司，分選MACS微珠(CD4)購自德國Miltenyi公司，HAT、HDAC活性試劑盒購自美國Biovision公司。對采集的靜脈血采用密度梯度離心法(Ficoll法)分離外周血單個核細胞，免疫磁珠進一步分離CD4+T細胞，ELISA法檢測吸光度。用試劑盒中一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算去乙酰化賴氨酸的濃度，來代表HAT、HDAC的活性。嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 推拿組臨床療效 臨床控制11例(36.67%)，部分控制17例(56.67%)，未控制2例(6.67%)，總有效率28例(93.34%)。

2.2 苗醫(yī)推拿前后血清細胞因子對比

表1 苗醫(yī)推拿前后血清IFN-γ、IL-4、IL-17對比

注：與健康對照組比較，△P<0.05；與推拿治療前比較，#P<0.05

表1結(jié)果提示：緩解期哮喘患兒血清IFN-γ、IL-4及IL-17顯著高于健康兒童(P<0.05)；苗醫(yī)推拿治療后與治療前比較，血清IFN-γ顯著升高，IL-4及IL-17顯著降低(均P<0.05)，與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 苗醫(yī)推拿前后外周血CD4+T細胞HAT、HDAC活性對比

表2 苗醫(yī)推拿前后外周血CD4+T細胞HAT、HDAC活性對比

注：與健康對照組比較，△P<0.05；與推拿治療前比較，#P<0.05。

表2結(jié)果是示：與健康對照組比較，緩解期哮喘患兒外周血CD4+T細胞HAT活性增強，HDAC活性減弱(均P<0.05)；苗醫(yī)推拿治療后與治療前比較，HAT活性降低，HDAC活性增強(均P<0.05)，與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討論

湘西劉氏小兒推拿流派是國內(nèi)著名的小兒推拿流派之一[6]，推拿名家嚴(yán)雋陶教授就推拿學(xué)源流特別指出“魯東湘西的兒科推拿”各具特色[9]。哮喘患兒緩解期主要表現(xiàn)為肺脾腎三臟的虛損，苗醫(yī)推拿治療緩解期哮喘以調(diào)治臟腑、增強體質(zhì)、預(yù)防復(fù)發(fā)為目的，體現(xiàn)了中醫(yī)“未病先防、既病防變”的治未病理念。推治過程中開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次為本流派常例“開竅”手法；推治五經(jīng)根據(jù)五行生克、助制[10]之理，采用“補三抑一法”，即主補腎經(jīng)，兼補肺經(jīng)、次補脾經(jīng)、稍清肝經(jīng)，重在補腎、肺、脾三經(jīng)治其本，斷其伏痰，清肝經(jīng)以防肝旺乘脾侮肺；肺俞、膻中寬胸理氣，宣肺化痰；揉中脘、板門、足三里，捏脊健脾化濕；揉丹田、外勞宮溫補陽氣；按肩井“關(guān)竅”。從臨床實踐來看，苗醫(yī)推拿能有效控制哮喘，預(yù)防復(fù)發(fā)(總有效率達93.34%)。

IL-4與哮喘氣道重塑的發(fā)生存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)性；IFN-γ有利于Th1細胞的分化，而抑制Th2的分化，達到Th1/Th2的平衡狀態(tài)，從而使哮喘患者的氣道炎癥得到控制[11]；IL-17在哮喘的炎癥中發(fā)揮重要作用，表達水平與哮喘發(fā)作程度呈正相關(guān)[12]。本研究印證了緩解期哮喘兒童Th1/Th2平衡紊亂、Th1及Th17應(yīng)答增強，并證實了苗醫(yī)推拿能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，下調(diào)IL-17含量(均P<0.05)。

表觀遺傳學(xué)的改變在哮喘的發(fā)病機制中起著重要作用[13]。表觀遺傳學(xué)研究不涉及DNA序列改變的基因表達調(diào)控，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化與非編碼調(diào)節(jié)性RNA調(diào)控。組蛋白修飾包括乙酰化、甲基化和磷酸化等，其中乙?；叭ヒ阴；揎椦芯枯^多，是動態(tài)的可逆的修飾。HAT促進組蛋白乙酰化和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而HDAC促進組蛋白去乙酰化，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。哮喘患者支氣管肺泡灌洗液巨噬細胞及活檢肺組織標(biāo)本中HAT活性增強伴隨HDAC活性降低[14]，外周血單個核細胞也存在同樣的改變[15]。本研究結(jié)果顯示，苗醫(yī)推拿治療3個月后，患兒外周血CD4+T細胞HAT活性顯著降低而HDAC活性顯著升高(均P<0.05)，說明苗醫(yī)推拿可抑制HAT活性，增強HDAC活性，減弱組蛋白乙?；@可能是其調(diào)節(jié)哮喘患兒免疫平衡的表觀遺傳學(xué)機制之一，但能否長期保持這種表觀遺傳學(xué)狀態(tài)，還需要進一步研究。

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湖南省中醫(yī)藥管理局科研課題(項目編號：2013104)。

李中正(1985- )，男，土家族，湖南慈利人，碩士，講師，執(zhí)業(yè)中醫(yī)師，主要從事推拿學(xué)的教學(xué)科研工作。

R29

A

1007-8517(2014)07-0011-02

2014.01.06)