突破光學(xué)顯微鏡的極限

本刊記者

瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家埃里克·貝齊格、威廉·莫納和德國(guó)科學(xué)家斯特凡·黑爾，以表彰他們?yōu)榘l(fā)展超高分辨率熒光顯微鏡做出的貢獻(xiàn)。長(zhǎng)期以來，光學(xué)顯微鏡的分辨率都被認(rèn)為是有極限的，即不可能超過光波波長(zhǎng)的一半，這被稱為“阿貝極限”。然而，獲獎(jiǎng)的3位科學(xué)家打破了這一極限，使光學(xué)顯微鏡步入了納米時(shí)代。

為什么說光學(xué)顯微鏡是有極限的？

顯微鏡的發(fā)明打開了通往微觀世界的大門。顯微鏡的最早起源可追溯至1590年的荷蘭，當(dāng)一位眼鏡商人的兒子在玩弄鏡片時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)兩塊透鏡在一定距離觀察物體時(shí)，物像顯得格外大。把兩塊透鏡固定在直徑不同的圓筒上，并使小圓筒能在大圓筒內(nèi)自由滑動(dòng)，這便成了今天顯微鏡的原始雛形。1665年，英國(guó)人羅伯特·胡克用他制作的顯微鏡觀察樹皮切片，看到一些密集排列的小孔，他稱之為“cell”，現(xiàn)在我們沿用了這個(gè)名稱，中文翻譯為“細(xì)胞”。作為細(xì)胞的命名人，胡克當(dāng)時(shí)所看到的其實(shí)并不是真正意義上的細(xì)胞。與胡克同時(shí)代的荷蘭人列文虎克憑借他精心磨制的鏡片制成了更精密的顯微鏡，第一次發(fā)現(xiàn)了血液里的細(xì)胞以及土壤中各種各樣的微生物。

前面提到的顯微鏡是光學(xué)顯微鏡，也就是利用可見光，將微小物體形成放大影像的光學(xué)儀器。經(jīng)過不斷的改進(jìn)，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)可以達(dá)到放大1600倍的效果了，這意味著科學(xué)家們可以辨別完整細(xì)胞，以及其中比較大的細(xì)胞器（如葉綠體、線粒體）的輪廓結(jié)構(gòu)，但卻無法分辨一個(gè)正常大小的病毒或者單個(gè)蛋白分子。那么，光學(xué)顯微鏡的放大效果有沒有可能繼續(xù)甚至是無限提高呢？

很遺憾，答案是否定的。光學(xué)顯微鏡的分辨率是有一個(gè)極限的，也就是說，用光學(xué)顯微鏡永遠(yuǎn)無法看到小于光波長(zhǎng)一半的物體。這個(gè)極限被稱為“阿貝極限”，它是德國(guó)物理學(xué)家、光學(xué)家恩斯特·阿貝于19世紀(jì)70年代提出來的。阿貝發(fā)現(xiàn)，可見光由于其波動(dòng)特性，會(huì)發(fā)生衍射，因而光束不能聚焦到無限小?？梢姽獠ㄩL(zhǎng)范圍為400納米～780納米，以可見光中波長(zhǎng)最短的藍(lán)紫光來說，其波長(zhǎng)在400納米左右，因此，如果兩點(diǎn)之間的距離小于200納米，我們將無法分辨出這兩個(gè)點(diǎn)（如圖1）。

一個(gè)多世紀(jì)以來，200納米的“阿貝極限”一直被認(rèn)為是光學(xué)顯微鏡理論上的分辨率極限，小于這個(gè)尺寸的物體必須借助電子顯微鏡才能觀察。

電子顯微鏡是20世紀(jì)二三十年代發(fā)展起來的成像技術(shù)，它利用高能短波長(zhǎng)電子束代替可見光作為光源，通過電子束與物體衍射作用工作，放大倍數(shù)可高達(dá)數(shù)十萬倍。既然有了分辨率極高的電子顯微鏡，科學(xué)家是不是就沒有必要再糾結(jié)于光學(xué)顯微鏡的分辨率極限了呢？并不是這樣的。因?yàn)殡娮语@微鏡需要在真空條件下工作，還要經(jīng)過復(fù)雜的標(biāo)本處理過程，所以很難觀察活的樣本，而且電子束的照射也會(huì)使生物樣品受到輻照損傷。對(duì)于生物學(xué)家而言，還有什么比讓細(xì)胞活生生地出現(xiàn)在眼前更令人激動(dòng)的呢？

突破“阿貝極限”的兩種方案

熒光顯微鏡也是一種光學(xué)顯微鏡，故同樣跳不出“阿貝極限”，只不過利用熒光分子為細(xì)小的物體“標(biāo)記”，科學(xué)家可以更有針對(duì)性地觀察和追蹤他們感興趣的內(nèi)容。在突破“阿貝極限”的方案中，有兩種各自獨(dú)立發(fā)展出來的技術(shù)方法。

如圖1所示，光源一次把處于這個(gè)半徑里面的粒子照亮，看起來模糊一片，根本無法分辨每一個(gè)粒子。斯特凡·黑爾想到一個(gè)絕妙的點(diǎn)子：既然一次都亮起來看不清，那我就分兩步。簡(jiǎn)單來說，就是用兩束激光，一束激光激發(fā)熒光分子發(fā)光（圖2左），這個(gè)光斑已達(dá)分辨率的極限，不能再小了；另一束激光則比較特殊（圖2中），就把它想象成一個(gè)“面包圈”吧！當(dāng)兩束光聚焦到同一個(gè)點(diǎn)上，第二束光就把第一束光給滅了，只有中間那個(gè)點(diǎn)沒有滅掉（圖2右），這更小的點(diǎn)便突破了分辨率的極限。這就是斯特凡·黑爾開發(fā)出的STED顯微鏡的原理，STED全名是Stimulated Emission Depletion，意為受激發(fā)射損耗。斯特凡·黑爾正是利用這個(gè)原理，通過巧妙的設(shè)計(jì)，將STED顯微鏡的光斑尺寸變得非常小，然后用它一小點(diǎn)一小點(diǎn)地去掃描整個(gè)觀察區(qū)域，就得到了分辨率高于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的圖像。

貝齊格和莫納則通過各自的獨(dú)立研究，為另一種顯微鏡技術(shù)——單分子熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。與STED不同，這種方法不是在顯微鏡的光斑尺寸上做文章，也不必先“點(diǎn)亮”再“熄滅”，而通過類似圖像疊加的原理，巧妙地?cái)[脫了“阿貝極限”的束縛。如圖3示意，不是相鄰兩點(diǎn)之間的距離小于200納米就無法分辨嗎？那么，我們就依靠“開關(guān)”單個(gè)熒光分子，分別讓不相鄰且間距大于200納米的兩點(diǎn)發(fā)光，這樣不就可以把它們區(qū)分開來嗎？然后，再把每一次得到的圖像疊加，用一定的數(shù)學(xué)方法加以處理，同樣能得到分辨率高于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的圖像。

光學(xué)顯微鏡步入納米時(shí)代

雖然這些新的光學(xué)顯微技術(shù)可以使我們看到更小的物體，但并不意味著“阿貝極限”被推翻了，科學(xué)家們只是另辟蹊徑地繞過了這個(gè)障礙。一旦掙脫了極限的束縛，光學(xué)顯微成像技術(shù)便向納米尺度大幅邁進(jìn)，并將為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。

以STED技術(shù)為例，它在理論上已經(jīng)可以達(dá)到40納米～50納米的分辨率。從此以后，科學(xué)家們就能在顯微鏡下“實(shí)時(shí)”觀察活體生物細(xì)胞內(nèi)單個(gè)分子的運(yùn)動(dòng)情況了。他們可以觀測(cè)分子如何在腦神經(jīng)細(xì)胞之間建立突觸，可以研究與帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥和亨廷頓氏癥有關(guān)的蛋白質(zhì)變化情況，還可以追蹤胚胎內(nèi)部細(xì)胞的分裂過程。這也正是3位獲獎(jiǎng)?wù)咭约捌渌S多科學(xué)家們目前所從事的工作。

3位獲獎(jiǎng)?wù)叩暮?jiǎn)介如下：

斯特凡·黑爾：1962年生于羅馬尼亞，目前任職于德國(guó)馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所和德國(guó)癌癥研究所。

埃里克·貝齊格：1960年生于美國(guó)，目前任職于美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所。

威廉·莫納：1953年生于美國(guó)，目前任職于美國(guó)斯坦福大學(xué)。

【責(zé)任編輯】龐 云