腦梗死患者外周血血清和血漿中白細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1水平差異分析

湯加 周春剛 蘇偉 張志斌

細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡失調(diào)是血管重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的主要病理過(guò)程，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）屬于基質(zhì)蛋白酶家族，能夠降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時(shí)也是變性和炎癥過(guò)程的主要調(diào)節(jié)分子，在血管壁重構(gòu)以及心腦血管病發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，目前MMPs已經(jīng)作為動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管病的預(yù)測(cè)因子［1］。本研究旨在探討血清及血漿中白細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）的水平差異，為腦組織損傷生物標(biāo)志物的選擇提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 一般資料 收集臨床資料：腦梗死患者116例為腦梗死組，男61例，女55例。年齡51～77歲，平均（68.0±6.6）歲。健康體檢者43例為健康組，男 23例，女20例。 年齡48～59歲，平均（53.0±5.7）歲。 所有病例經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)，臨床表現(xiàn)符合《中國(guó)腦血管病防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)?。?周的患者。腦梗死納入標(biāo)準(zhǔn)：符合動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死、腔隙性梗死的診斷，并具有神經(jīng)功能缺損的臨床表現(xiàn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）；腦出血；發(fā)?。?周；經(jīng)檢查證實(shí)由腦腫瘤、腦外傷、血液病等引起的卒中患者，因風(fēng)濕性心臟病、冠心病及其他心臟病合并房顫引起腦栓塞者；合并有肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病、精神病者。

1.2 方法 血清、血漿采集：分別采用無(wú)促凝劑的采血管、含EDTAK2抗凝管（購(gòu)自上?？迫A）清晨空腹采血，3000 r／min離心20 min，取上清置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

MMP9和TIMP-1的水平檢測(cè)：采用ELISA法，樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)復(fù)孔，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，采用ELISA-0.2軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的四參數(shù)Logistic曲線擬合方程，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。ELISA試劑購(gòu)自蘇州科創(chuàng)生物技術(shù)公司，Biotek酶標(biāo)儀（美國(guó) ELX800）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5，血清和血漿組間MMP9及TIMP-1含量差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。腦梗死組與健康組血漿 MMP9和TIMP-1差異比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組血清和血漿MMP9和TIMP-1水平比較 116例腦梗死患者血清和血漿中MMP9水平及TIMP-1水平均呈線性相關(guān)，血清MMP9水平顯著高于血漿MMP9水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。血清TIMP-1水平亦顯著高于血漿TIMP-1水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 腦梗死組血清和血漿MMP9、TIMP-1比較（±s，μg／L，n=116）

表1 腦梗死組血清和血漿MMP9、TIMP-1比較（±s，μg／L，n=116）

注：與血清比較，??P＜0.01

指標(biāo) 血清 血漿 相關(guān)系數(shù)（r）

2.2 腦梗死組與健康組血漿MMP9和TIMP-1水平比較 本研究腦梗死組MMP9血漿水平顯著高于健康組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而腦梗死組TIMP-1血漿水平顯著低于健康組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。

3 討論

正常和病態(tài)血管壁細(xì)胞能夠在可溶性細(xì)胞因子以及細(xì)胞和細(xì)胞血小板白細(xì)胞之間相互作用活化和上調(diào)MMPs水平，MMPs活性增強(qiáng)有益于基質(zhì)的轉(zhuǎn)化，血管的修復(fù)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，但是也能導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成［2］。MMP9和TIMP-1水平的不同不僅與疾病狀態(tài)相關(guān)，同時(shí)也與血凝和纖維溶解途徑相關(guān)。凝血過(guò)程中凝血酶能夠促進(jìn)MMP9前體和MMP9的活化，凝血酶產(chǎn)生纖維蛋白，連接MMP9單體的纖維蛋白連接域，繼而活化的MMP9單體在血清聚集，在纖維蛋白溶解過(guò)程，尿激酶纖溶酶原激活劑促進(jìn)白細(xì)胞產(chǎn)生MMP9［3］，外周血中MMPs和TIMP-1水平在血清與血漿水平存在差異，血清MMP9和TIMP-1的水平高于含有抗凝劑的血漿，本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相一致［4］，由于血小板和白細(xì)胞在聚集或活化時(shí)能夠釋放MMP9和TIMP-1，而使用抗凝劑能夠抑制血小板和白細(xì)胞釋放MMP9和TIMP-1［5］。因此對(duì)于研究MMP9和TIMP-1作為生物學(xué)標(biāo)志和其在病理生理過(guò)程中的角色，采血方法和樣本前處理非常重要。忽視采血方法對(duì)結(jié)果的影響，可能影響對(duì)正常結(jié)果的判斷分析。

表2 2組血漿MMP9、TIMP-1水平比較（±s，μg／L）

表2 2組血漿MMP9、TIMP-1水平比較（±s，μg／L）

注：與健康組比較，??P＜0.01

組別 n MMP9 TIMP-1腦梗死組 116 837.82±73.5?? 83.57±7.0??健康組 43 181.36±7.3 186.61±43.5

腦梗死在缺血組織內(nèi)以及其周圍出現(xiàn)高水平MMP9，可能引起出血原因是毛細(xì)血管基底膜大量Ⅳ膠原降解，紅細(xì)胞和白細(xì)胞外滲。MMPs由腦細(xì)胞和循環(huán)至腦組織的外周血白細(xì)胞產(chǎn)生，局部缺血后滲透的白細(xì)胞是MMP9的主要來(lái)源［6］。白細(xì)胞MMP9敲除嵌合子小鼠與MMP9敲除鼠具有相同表現(xiàn)。腦組織和血中MMP9促進(jìn)神經(jīng)元死亡、炎癥、滲透、神經(jīng)血管損傷。MMP9參與神經(jīng)和血管病理生理過(guò)程。血漿水平MMPs已經(jīng)作為腦組織損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志［7-8］。與健康人比較，缺血性腦卒中患者外周血MMP9水平增高，且與缺血面積及神經(jīng)癥狀有關(guān)［9］，TIMP-1作為MMP9活性的主要抑制物，與MMP9特異性結(jié)合，TIMP-1和MMP9之間平衡調(diào)節(jié)是血管重構(gòu)的關(guān)鍵，TIMP-1和MMP9之間平衡失調(diào)可能導(dǎo)致腦卒中后梗死擴(kuò)大，損傷血腦屏障［8］。

總之，血漿水平MMP9和TIMP-1更適合作為腦組織損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志，使用血清標(biāo)本檢測(cè)MMP9和TIMP-1可能產(chǎn)生分析前的偏倚。

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