單氰氨誘導(dǎo)巨峰葡萄休眠解除過(guò)程中重要基因表達(dá)的差異

曹慕明，陳國(guó)品,李洪艷，韓佳宇，盤豐平，謝蜀豫，白先進(jìn)，王 博，黃 露，文仁德

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004）

對(duì)自然休眠進(jìn)程調(diào)控是目前果樹(shù)設(shè)施栽培中亟待解決的問(wèn)題。利用藥劑處理打破落葉果樹(shù)休眠的研究國(guó)內(nèi)不多，更缺乏應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的報(bào)道。在國(guó)外，這方面的研究和應(yīng)用較多[1-2]。應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)打破葡萄休眠，促進(jìn)植物反季節(jié)生產(chǎn)是研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外目前常用于打破休眠的化學(xué)物質(zhì)有礦物油、含氮化合物、含硫化合物和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如氰氨基化鈣、H2CN2、石灰氮、TDZ、GA3、6-BA和單氰氨等，都是很有效的破眠物質(zhì)[3]。

隨著單氰氨的逐步推廣，研究單氰氨調(diào)控促進(jìn)葡萄萌芽的生理效應(yīng)以及分子作用機(jī)理方面已顯得越來(lái)越重要，葡萄分子生物學(xué)研究也逐漸得到重視。

該研究在本課題組單氰氨誘導(dǎo)葡萄解除休眠技術(shù)以及生理機(jī)理研究[4-5]的基礎(chǔ)上，以巨峰葡萄品種為材料，利用cDNA-SRAP技術(shù)分析葡萄在單氰氨調(diào)控作用下基因差異表達(dá)情況，進(jìn)而探討單氰氨調(diào)控葡萄萌芽的分子機(jī)理，為單氰氨的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

葡萄品種為巨峰葡萄，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所提供，為常規(guī)露地栽培模式。試驗(yàn)所需試劑、酶類、SRAP分析所用引物購(gòu)自上海生工、Promega公司、Fermentas公司和 New Englad公司；藥劑單氰胺購(gòu)自寧夏大榮生物公司。

1.2 單氰氨處理及采樣

對(duì)結(jié)果枝進(jìn)行摘葉后，每樹(shù)留枝（正常老熟）16～17條，每枝留8～10芽進(jìn)行回縮修剪，之后用棉球浸蘸2.5%單氰氨溶液涂抹剪口芽以下的第一、第二芽（剪口芽不涂藥）；對(duì)照枝條進(jìn)行同樣修剪，修剪后噴清水。

試驗(yàn)處理其它大田管理按正常的葡萄生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行管理。處理后 0、12、24、36、48h分別對(duì)葡萄剪口芽以下的第一、第二芽進(jìn)行取樣，每次取樣時(shí)處理和對(duì)照各取30個(gè)芽，取樣后樣品立即進(jìn)行RNA分離或小心剝離芽體鱗皮，去污后經(jīng)液氮速凍后貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模板的制備

1.3.1 總RNA的分離及其純度和完整性檢測(cè)

用于RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄的溶液均用0.1%（體積分?jǐn)?shù)）DEPC處理水配制；所用的塑料制品均用0.1%DEPC浸泡2d、高壓滅菌并烘干后備用，玻璃器皿經(jīng)200℃烘烤3h。

提取緩沖液：0.1mol/LTris-硼酸緩沖液（pH 8.0），其中含 30g/L CTAB，2.0mol/L NaCl，30mmol/L EDTA-Na2，5%β-巰基乙醇（用前加入）。12mol/L LiCl，氯仿，75%乙醇（DEPC處理 H2O配制）。其中H2ODEPCRS：含10%RNAsafe（天為時(shí)代公司產(chǎn)品）的DEPC處理H2O。DNaseⅠ（TaKaRa公司產(chǎn)品）。2×Taq PCR Oligo（Dt）18 primer，SRAP 引物以及Master Mix酶（上海生物工程有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TOYOBO公司。其余生化試劑苯酚、氯仿、無(wú)水乙醇、冰醋酸、Tris、EDTA、β-巰基乙醇、SDS均為國(guó)產(chǎn)分析純，TAE緩沖液加0.1%DEPC處理12h后，滅菌后備用。

實(shí)驗(yàn)具體操作如下：

（1）向1.5mL離心管中加入600uL SDS提取液，60uL β-巰基乙醇，300uL Tris苯酚和 300uL氯仿，將葡萄葉片用液氮研磨后迅速加入離心管中（每管不超過(guò)0.2g材料），用旋渦震蕩器劇烈震蕩 3min，于 4℃低溫，12000rpm，離心 5min。

（2）取上清液至1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿，用旋渦震蕩器劇烈震蕩3min，于4℃低溫，12000rpm，離心 5min。

（3）重復(fù)（2）1次。

（4）取上清液至1.5mL離心管中，向上清液中加入等體積的4M LiCl和上清液1/2體積的無(wú)水乙醇，混勻后放置冰上10min，于4℃低溫，12000rpm，離心10min，小心棄去上清液，收集沉淀，用75%乙醇洗滌2次，無(wú)水乙醇2次，稍晾干。

（5）沉淀溶于適量DEPC水中，加入等體積的氯仿，用旋渦震蕩器劇烈震蕩3min，于4℃低溫，12000rpm，離心 5min。

（6）重復(fù)（5）1次。

（7）取上清液至1.5ml離心管中，向上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后放置冰上10min，于 4℃低溫，12000rpm，離心 10min，小心棄去上清液，收集沉淀，用75%乙醇洗滌2次，無(wú)水乙醇2次，稍晾干。

⑧沉淀溶于適量DEPC水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取RNA樣品4μL，用DEPC水稀釋至1mL，混勻，在TU1800SPC紫外分光光度計(jì)測(cè)定230～280nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光值，并計(jì)算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm比值，以檢測(cè)樣品的純度。根據(jù) RNA（μg/μL）=OD260nm×40mg/L×稀釋倍數(shù)/1000，計(jì)算樣品的RNA濃度。用1.0%瓊脂糖凝膠在1×TBE（Tris硼酸EDTA）緩沖系統(tǒng)下進(jìn)行電泳檢測(cè)其完整性。

1.3.2 cDNA第一鏈的合成

cDNA第一鏈的合成是采用上海生物工程有限公司生產(chǎn)的M一MuLv（RNaseH一）進(jìn)行的RNA反轉(zhuǎn)錄，參照M-MULV反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，具體操作如下：

（1）在冰上加入下列反應(yīng)混合物混合：

總 RNA（100nng/μL） 4μL

Oligo（Dt）18primer（50μΜ）2.5μL

DEPC處理水 Up to 30μL；

（2）離心3～5s，在70℃條件下保溫5min后，迅速冰上冷卻并加入下列成分：

5×反應(yīng)緩沖液 6.0μL

10mM dNTPs 2.0μL

RNA 酶抑制劑（20∪/μL） 1.0μL

（3）離心3～5s，在37℃條件下保溫5min后在冰上加入下列成分：

M-Mulv反轉(zhuǎn)錄酶（200∪/μL） 1.0μL

（4）混合，在42℃條件下保溫90min，移入85℃保溫10min，產(chǎn)物直接用于cDNA第二鏈合成或保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 cDNA第二鏈的合成

第二鏈的合成反應(yīng)體系如下：

將上述反應(yīng)混合液置于16℃條件下冰浴30min，加入 RNase H（60∪/μL）0.25μL混勻，16℃繼續(xù)冰浴4h后轉(zhuǎn)移到22℃保溫2h，置換合成cDNA第二鏈。

1.3.4 cDNA的純化

（1）加6倍體積的ddH2O到1倍體積的cDNA中，混勻。

（2）用等體積的氯仿抽提，12000rpm離心5min。

（3）取上清液，加入2倍體積的無(wú)水乙醇并置于-20℃環(huán)境中1h。

（4）混合液于12000rpm離心10min，棄上清，將沉淀溶于適量的ddH2O或TE（pH8.0）中。

1.4 SRAP-PCR擴(kuò)增

根據(jù)L和Q等[6]設(shè)計(jì)SRAP引物序列方法，選用不同的3’端選擇堿基，共設(shè)計(jì)了64條正向引物序列和64條反向引物，由上海生工合成。該實(shí)驗(yàn)選擇性地選用了540對(duì)引物組合。

擴(kuò)增體系和程序主要參考L和Q等[6]提供的方法，略加更改。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表1。

PCR反應(yīng)程序按下列參數(shù)進(jìn)行：

94℃預(yù)變性5min；

94℃ lmin，35℃ lmin，72℃ 1min，5個(gè)循環(huán)；

94℃ lmin，50℃ lmin，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min。

1.5 非變性丙烯酞胺凝膠電泳檢測(cè)

電泳檢測(cè)采用Budowle[7]和Bassan[8]的方法稍作修改后進(jìn)行。配膠一灌膠一凝固一取梳子一電泳，本實(shí)驗(yàn)采用6%的聚丙烯酰胺凝膠包括：6%的聚丙烯酰胺、0.04%過(guò)硫酸膠、0.1%TEMED。

（1）擴(kuò)增后的SRAP產(chǎn)物加入2μL上樣緩沖液，上樣量2μL，電泳緩沖液是0.5xTBE。在DYCz-30型電泳槽上進(jìn)行，150mA恒流電泳35min。

（2）切斷電源，取下膠板，剝下凝膠，放入300mL固定液中，輕輕搖動(dòng)12min。

（3）倒掉固定液，加300ml染色液中，輕輕搖動(dòng)12min。

（4）從染色液中取出凝膠，放入500mL的雙蒸水中，漂洗1～2min，再轉(zhuǎn)入雙蒸水中漂洗1～2min；

（5）凝膠浸入顯色液，輕輕搖動(dòng)約5～8min，至出現(xiàn)清晰譜帶。

（6）待凝膠完全顯色后，讀取cDNA片段大?。ǜ鶕?jù)100bp DNA Marker確定）及帶型。

1.6 SRAP二次擴(kuò)增及電泳檢

選擇有差異條帶出現(xiàn)的SRAP引物，進(jìn)行二次擴(kuò)增，體系與1.4相同，電泳檢測(cè)與1.5相同。

1.7 聚丙烯酞胺凝膠回收差異片段

用改進(jìn)的Maxam和Gilbert[9]的破碎浸泡法回收cDNA差異片段。步驟如下：

（1）用手術(shù)刀片把二次擴(kuò)增具有同樣差異的目的帶切割下來(lái)。

（2）把切下來(lái)的膠片放入離心管中，用槍頭在管中把膠片搗碎。

（3）估計(jì)碎膠片的體積，加入2倍體積的Elution Buffer。

（4）蓋上蓋子，常溫下12h。

（5）在 4℃下，12000rpm 離心 10min，移上清液于另一個(gè)離心管中（注意不要帶有凝膠碎塊）。

（6）加0.5倍體積Elution Buffer于殘?jiān)?，輕輕渦旋2min，離心（同上）取上清移到原上清液的管中。

（7）用帶有濾網(wǎng)的注射器把上清液中所有的凝膠殘片過(guò)濾掉。

（8）用酚：氯仿（1∶1）200μL純化提出的 DNA，（以除去SDS）離心（同上）取上清液于另一管中。

（9）用乙醇沉淀DNA，離心（同上），倒掉上清液，干燥后用200μL TE溶解DNA，及25μL的醋酸鈉（3M），再加2倍體積的乙醇再次沉淀DNA。

（10）小心用70%的乙醇洗滌沉淀，干燥后用10μL TE 溶解 Cdna。

（11）作檢測(cè)并進(jìn)行隨后實(shí)驗(yàn)（以原來(lái)的片段擴(kuò)增帶 Marker）。

1.8 回收片段再次擴(kuò)增及檢測(cè)

把1.7回收所得的片段，用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，以備瓊脂糖凝膠回收使用。體系擴(kuò)大5倍，程序與1．6相同。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，緩沖液為lxTAE，原回收cDNA片段為對(duì)照。

1.9 瓊脂糖凝膠DNA回收

瓊脂糖凝膠回收利用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的膠回收（小量）試劑盒（W5611）回收純化目的片段，步驟如下：

（1）在W1洗脫液中加入48mL無(wú)水乙醇。

（2）割下含cDNA的瓊脂糖塊，使它盡可能小，放入1.5mL離心管中。

（3）按每100mg瓊脂糖塊加300μL SA液的比例加入SA液，100mg以下的凝膠加300μL凝膠裂解液SA，置40℃水浴10min，使瓊脂塊完全溶化，每2min顛倒混勻1次。

（4）將溶化后的瓊脂糖移入吸附柱，12000rpm離心30s，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入收集管。

表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

（5）在吸附柱中加入500μL w1液，12000rpm離心15s，倒掉收集管中液體，將吸附柱放入收集管。

（6）在吸附柱中加入500μL w1液，靜置1min后，12000rpm離心15s，倒掉收集管中液體，將吸附柱放入收集管。

（7）12000rpm 離心lmin。

（8）將吸附柱放入1個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，在吸附膜中央加入2mMTris30μL，靜置1min后，離心 lmin，將 1.5mL的離心管（cDNA）貯存于-20℃。

1.10 目的片段的生物克隆

1.1 0.1 DH5a感受態(tài)的制備

采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述氯化鈣二次重懸法：

①?gòu)腄H5a的LB平板上挑取1個(gè)單菌落接種于三角瓶中加20mL LB液體培養(yǎng)基。

②37℃、225rpm培養(yǎng)過(guò)夜至OD600=0.5左右。

③吸取200μL菌液接種于新鮮的20mL LB液體培養(yǎng)基中。

④37℃下 225～250rpm培養(yǎng)約 2.5～4h至OD600=0.5左右。

⑤將菌液轉(zhuǎn)入1個(gè)50mL無(wú)菌離心管中，冰浴10min。

⑥5000rpm，4℃，離心 6min。

⑦棄上清液，用8mL冰預(yù)冷的0.lmol/L CaCl2輕輕重懸菌體至均勻。

⑧冰水浴30min。

⑨5000rpm，4℃，離心 6min。

⑩棄上清液，用冰預(yù)冷的0.lmol/L CaCl2輕輕重懸菌體至均勻。

?加無(wú)菌甘油至終濃度12.5%左右，分成每管100μL的小份，于-70℃保存?zhèn)溆谩?.10.2 cDNA回收片段與pMD18.Tvector載體的連接

①在冰水浴上向一個(gè)500mL無(wú)菌離心管中混合以下試劑，總體積為10μL：

目的cDNA 4.5μL

②混合液于16℃連接10～12h或過(guò)夜。1.10.3 cDNA與PMD18-T Vector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)

①將10μL連接產(chǎn)物輕輕加入1管DH5a感受態(tài)中，輕輕混勻。

②冰水浴30min。

③42℃熱激90s。

④迅速冰水浴2min。

⑤加入900μL室溫LB液體培養(yǎng)基。

⑥37℃，180rpm復(fù)蘇培養(yǎng)60～90min，同時(shí)在37℃預(yù)熱一個(gè)LB/Amp平板。

⑦先在平板上涂布20μL X-gal和5μL IPTG。

⑧復(fù)蘇時(shí)間到后取出試管，于5000rpm離心5min。

⑨吸去900μL上清液，用余下的100μL上清液重懸菌體至均勻。

⑩將重懸的菌體均勻涂布于平板上。

1.1 0.4 轉(zhuǎn)化重組載體后的DH5a單斑菌液的培養(yǎng)和菌液PCR鑒定

①當(dāng)轉(zhuǎn)化目標(biāo)cDNA片段的DH5a重組子的單斑在37℃培養(yǎng)18h左右，菌斑長(zhǎng)至直徑約2mm大小時(shí)，取出平板。

②將平板在4℃冰箱放置1h左右，待藍(lán)白斑區(qū)分明顯。

③用滅菌了的白色的移液槍槍頭挑取白色的單菌斑于將有1mL LB液體培養(yǎng)基和5mmol AMP的1.5mL無(wú)菌離心管中。

④在37℃，225～250rpm的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)單斑菌液8～10h。

⑤以單斑菌液為模板，用與擴(kuò)增目標(biāo)片段時(shí)基本相同的條件，作目標(biāo)片段的長(zhǎng)度檢測(cè)。

做菌液PCR檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)體系和程序和生成目的片段的PCR反應(yīng)一致。

⑥對(duì)菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及熒光染色檢測(cè)。

1.11 重組克隆的反向Northern鑒定

采用Roche的地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitlⅢ）進(jìn)行雜交檢測(cè)，方法按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

（1）探針標(biāo)記。取差減PCR產(chǎn)物1μL，加無(wú)菌去離子水15μL，PCR儀上98℃變性10min，立即冰浴10min。徹底混勻 DIG-High Prime，取 4μL加入變性樣品中。短暫離心，37℃標(biāo)記過(guò)夜，65℃加熱10min，中止標(biāo)記反應(yīng)。

（2）菌落PCR產(chǎn)物斑點(diǎn)印跡膜制備。

①將帶正電荷的尼龍膜裁成合適大小，將其置于濾紙上。

②在各菌落PCR樣品中加入菌落PCR產(chǎn)物，在98℃變性10min，立即冰浴10min，將各管離心5s。

③用微量加樣器吸取樣品1μL點(diǎn)于膜上，使其晾干。點(diǎn)兩張相同的膜，分別與正向和反向探針雜交。

（3）雜交與檢測(cè)。方法按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.12 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化重組子的測(cè)序和序列的生物信息學(xué)分析

陽(yáng)性克隆子的測(cè)序工作由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Invitrogen，China）商業(yè)化完成，采用通用引物M13F/M13R組合起始測(cè)序。

序 列 對(duì) 比 在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.ih.gov/網(wǎng)站上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板制備

利用SDS法從葡萄的鱗芽中提取的總RNA，先在1500rpm、4℃離心去除葡萄組織，然后進(jìn)行飽和酚抽提2遍后再用氯仿抽提，能有效減少RNA樣品中多糖等次生代謝物的污染，提高RNA的質(zhì)量。從電泳結(jié)果看（圖1），利用該方法從葡萄的鱗芽中提取的RNA在瓊脂糖凝膠電泳中28、18s和5s 3條帶型清晰整齊，完整性好，無(wú)DNA污染，而28SrRNA帶的亮度明顯大于18s條帶，泳道中無(wú)背景，未見(jiàn)蛋白質(zhì)和多糖，沒(méi)有明顯的降解；樣品的OD260/0D280介于1.8～2.0之間，說(shuō)明該方法提到的總RNA中蛋白質(zhì)污染很少，純度較高，總RNA完整性好。

圖1 總RNA（1、2葡萄芽總RNA）的電泳圖

2.2 單氰氨調(diào)控葡萄基因的表達(dá)

2.2.1 電泳結(jié)果分析

在葡萄芽體萌動(dòng)前分別利用單氰氨和清水進(jìn)行處理，然后進(jìn)行基因差異表達(dá)研究。結(jié)果表明處理和對(duì)照在聚丙烯酞胺變性凝膠電泳中顯示條帶都比較多，條帶數(shù)量范圍在5～20條之間，其中大多數(shù)在10條左右，處理和對(duì)照的電泳結(jié)果顯示，在單氰胺作用下，葡萄的基因部分受誘導(dǎo)表達(dá)、部分受抑制，兩者之間差異明顯（圖2）。

圖2 電泳結(jié)果差異表達(dá)分析Marker：DL2000

2.2.2 單氰氨調(diào)控基因的篩選

我們利用540對(duì)引物組合對(duì)單氰氨處理和對(duì)照的葡萄芽體RNA混合池的樣品進(jìn)行差異表達(dá)分析，處理和對(duì)照共獲得1200多條穩(wěn)定條帶，長(zhǎng)度在50～500bP之間。2次PCR重復(fù)擴(kuò)增重復(fù)率為62.7%，兩次擴(kuò)增在對(duì)照和處理混合池間表現(xiàn)相同的差異片段有10條，長(zhǎng)度在50～500bP之間（圖3）。經(jīng)變性膠電泳展示后，對(duì)重復(fù)性較好的差異表達(dá)的片段進(jìn)行回收分析。

圖3 回收TDFs電泳檢測(cè)1-11：回收 TDFs；Marker：DL2000

在綜合分析各引物組合擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳展示結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)部分?jǐn)U增穩(wěn)定、重復(fù)性好、差異較為明顯的片段進(jìn)行反向Northern雜交驗(yàn)證（圖4）。反向Northern雜交結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：在雜交的10個(gè)樣品中，6個(gè)差異明顯，4個(gè)沒(méi)有差異。這表明在所回收的差異片段中，假陽(yáng)性條帶占有較高的比例。

2.2.3 差異片段序列分析

圖4 反向Northern雜交（上：處理；下：對(duì)照）

從反向Northern雜交結(jié)果陽(yáng)性的TDFs中選取6個(gè)片段進(jìn)行克隆和序列分析，并把它們BLAST比較的部分信息列于表2。從克隆所得的3個(gè)TDFs中Esc1的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的編碼過(guò)氧化氫酶的基因序列具有較高的同源性；另外2個(gè)TDFs沒(méi)有在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相似的序列。

表2 部分差異片段序列分析結(jié)果

ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA TCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGG AAG（過(guò)氧化氫酶）

2個(gè)未知功能的克隆差異片段序列（Esc2、Esc3）

GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAA CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCC GGT

CTGAAACACTGCTGGTTGATTAACGTAGTT CTGAATATCAGGCGTGCCGGGTGATATGATAGG TACGTTGCTGTAACTATATTTTGAGAGCAGCAG TAAGACGCTCAGCATAAAATCATCTGTTGCAAT TCGTACGCAGGCAAATGGTCTGGCACTGGCCAA

3 討論與結(jié)論

Halaly[10]展示了HC和HS處理對(duì)選定基因表達(dá)形式影響的比較研究，兩種處理均誘導(dǎo)CAT、ADH和PDC的表達(dá)。然而，HS處理的葡萄芽中變化發(fā)生得較早，而HC處理的芽?jī)?nèi)側(cè)更強(qiáng)烈。據(jù)研究在正常生長(zhǎng)條件下，玉米CAT1在盾片、葉、上胚軸及未成熟果實(shí)內(nèi)表達(dá)，CAT2主要在種子萌發(fā)后的盾片中表達(dá)[11]。Norflurazon（NF）誘導(dǎo)玉米CAT1、CAT2轉(zhuǎn)錄水平的提高主要發(fā)生在葉內(nèi)，在盾片中無(wú)明顯變化[12]。創(chuàng)傷誘導(dǎo)玉米CAT1、CAT2和CAT3在幼胚中表達(dá)，而在幼葉中只有CAT1和CAT3表達(dá)[13]。臭氧誘導(dǎo)玉米CAT1和CAT3表達(dá)而抑制CAT2表達(dá)，在外源ABA作用下，CAT1表達(dá)，CAT3不變，而CAT2則降低[14-15]，光誘導(dǎo)玉米CAT2在葉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)在翻譯水平受到控制，黑暗抑制mRNA翻譯多肽的延伸，從而抑制CAT2的表達(dá)[16]。趙亞男等的研究表明:層積處理可使鉛筆柏種子內(nèi)脂肪及蛋白質(zhì)降解，氨基酸過(guò)氧化氫酶活性提高1倍，層積期間由于胞間聯(lián)絲的恢復(fù)，增強(qiáng)膜的透性，氧化酶和水解酶活性增加，呼吸作用加強(qiáng)，產(chǎn)生了大量ATP并為種子萌發(fā)提供了原動(dòng)力[17]。黨海山等[18]的研究表明：在萌發(fā)初期（萌發(fā)前3d）GA3處理，可以顯著地提高毛柄小勾兒茶種子中過(guò)氧化物酶的活性，從而促進(jìn)休眠解除，提高了萌芽率。SOD、POD和CAT是膜脂過(guò)氧化防御系統(tǒng)的主要保護(hù)酶，它們保持較高的活性可以迅速清除積累的活性氧，避免細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過(guò)氧化，使細(xì)胞得到保護(hù)，從而提高植物的抗逆性[19]。由前人的研究結(jié)果可知，在不同的組織、器官、發(fā)育時(shí)期及環(huán)境條件下，CAT基因表達(dá)具有精細(xì)的調(diào)控機(jī)制；而在人為解除植物組織休眠方面的研究結(jié)果表明，適宜的外界環(huán)境脅迫或物質(zhì)誘導(dǎo)下，休眠組織的過(guò)氧化氫酶活性提高而提早解除休眠，但具體CAT1、CAT2和CAT3基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控有待進(jìn)一步研究。另外張運(yùn)濤等[20]的研究結(jié)果單氰胺是一種植物休眠終止劑，它可有效地抑制植物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶的活性，加速植物體內(nèi)氧化磷酸戊糖（PPP）循環(huán)，從而加速植物體內(nèi)基礎(chǔ)性物質(zhì)的生成，刺激作物生長(zhǎng)，終止休眠。

本研究表明：經(jīng)單氰氨誘導(dǎo)葡萄休眠芽體，能比對(duì)照提早12d左右萌芽[5]，單氰氨處理后與對(duì)照的葡萄芽體基因表達(dá)出現(xiàn)了變化，用cDNASRAP技術(shù)分離了一些差異表達(dá)的基因，對(duì)在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)中差異明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的差異片段進(jìn)行回收克隆，獲得了一批差異表達(dá)的基因。經(jīng)反向Northern鑒定，得到了6個(gè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。用BLASTx在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)差異片段中Esc1表達(dá)的差異片段找到同源的基因序列并有相應(yīng)的基因功能注釋，有2個(gè)有未知基因功能的同源序列。獲得的已知基因功能的Esc1與玉米CAT2基因的同源性為74%。這一結(jié)果表明：CAT2基因是與植物的抗逆性、生長(zhǎng)、終止休眠等密切相關(guān)的因子，在單氰氨調(diào)控下差異表達(dá)。這與前人 Or[20]、Halaly[10]和 Redinbaughm[11]等的報(bào)道一致。但具體CAT2基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控有待進(jìn)一步研究。此外其他未知基因功能的差異表達(dá)可能也參與了單氰氨誘導(dǎo)巨峰葡萄休眠芽萌發(fā)的生理效應(yīng)，也可能與葡萄本身抵抗單氰氨作用的一系列防御應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

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