牛白細胞介素-17真核表達載體的構建及在牛乳腺上皮細胞中的表達

王婷，崔新潔，劉秉春，陶琳，胡慶亮，修磊，王瀟

(內(nèi)蒙古大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

牛白細胞介素-17真核表達載體的構建及在牛乳腺上皮細胞中的表達

王婷，崔新潔，劉秉春，陶琳，胡慶亮，修磊，王瀟

(內(nèi)蒙古大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

【目的】在體外分離培養(yǎng)牛乳腺上皮原代細胞，并構建牛白細胞介素-17(bIL-17)基因真核表達質(zhì)粒，觀察重組質(zhì)粒在牛乳腺上皮細胞的表達.【方法】提取牛脾臟細胞總RNA，通過RT-PCR擴增bIL-17，將bIL-17連入pMD19-T進行測序，測序成功后將bIL-17插入含有增強型綠色熒光蛋白報告基因的真核表達質(zhì)粒pEGFP-N3上，構建真核表達質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂質(zhì)體法將pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于牛乳腺上皮細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在細胞中的表達，RT-PCR檢測bIL-17基因在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，定量ELISA檢測bIL-17蛋白在細胞內(nèi)的表達情況.【結果和結論】成功構建具有綠色熒光和新霉素抗性的雙選擇標記的牛白細胞介素-17真核表達載體，并可在牛乳腺上皮細胞成功表達.

牛白細胞介素- 17;載體構建;牛乳腺上皮細胞;轉(zhuǎn)染;表達

奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一［1］.金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus造成乳房持續(xù)性感染的發(fā)病機制復雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺持續(xù)感染與奶牛乳腺上皮細胞分泌炎性因子能力不足，從而無法招募足夠的中性粒細胞到達炎性部位而清除病原細菌有關［2］.乳腺上皮細胞作為泌乳的功能性細胞，是病原菌進入乳腺后首先接觸的細胞，對病原微生物的識別顯得尤為重要，同時對乳腺的先天性免疫起到促進作用.故體外如何增強牛乳腺上皮細胞分泌炎性因子能力是解決乳腺持續(xù)感染的關鍵所在［3］.

牛白細胞介素-17(IL-17)由CD4+T細胞中的Th17細胞、單核細胞等分泌，最初被命名為細胞毒T淋巴細胞抗原8(CTLA-8)，是一種促炎性細胞因子［4］.研究發(fā)現(xiàn)IL-17存在6個家族成員(IL-17A、IL-17 B、IL-17 C、IL-17D、IL-17E、IL-17F)，目前對于IL-17A研究最為廣泛，一般所說的IL-17即為IL-17A［5］.現(xiàn)已表明，IL-17A具有強大的招募激活中性粒細胞和單核細胞的作用，IL-17可以誘導趨化性細胞因子如IL-8、單核細胞趨化因子21(MCP21)和GRO2-α的表達增高;IL-17還能夠誘導刺激機體分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎癥因子，在細菌、真菌、病毒等所致的感染性疾病中起著重要的抗感染作用［6-7］.已有試驗表明，重組IL-17在體外可刺激乳腺上皮細胞分泌細胞因子，增強乳腺上皮細胞的抗感染能力［8］.

本研究用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應技術克隆牛IL-17cDNA，構建具有綠色熒光和新霉素抗性的雙選擇標記真核表達重組質(zhì)粒，并在牛乳腺上皮細胞中得以表達，為后續(xù)奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎基因防治以及抗病轉(zhuǎn)基因奶牛的研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 動物組織與細胞培養(yǎng)

牛脾臟取自呼和浩特北亞清真屠宰場.牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)采用從乳汁中分離乳腺上皮細胞的方法，新鮮牛奶取自內(nèi)蒙古呼和浩特市小黑河鎮(zhèn)二道河村奶農(nóng)飼養(yǎng)的日產(chǎn)奶量40 kg的荷斯坦奶牛，取奶時間是產(chǎn)后2～4個月常乳.

1.2 主要試劑及儀器

PrimeScript RT reagent Kit、TaqTM、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraciong Kit Ver 3.0為TaKaRa公司產(chǎn)品;TIANprep Mini Plasmid Kit為TIANGEN公司產(chǎn)品;EcoRⅠ、SalⅠ、pMD19-T vector、T4 DNA Ligase為 TaKaRa公司產(chǎn)品;pEGFP-N3 vector及DH5α感受態(tài)大腸埃希菌Escherichia coli菌株由內(nèi)蒙古大學生命科學學院本科生創(chuàng)新實驗室保存;牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)試劑：完全培養(yǎng)液成分是FBS(體積分數(shù)為10%)+DMEM/F12+100 U雙抗+氫化考的松(1 μg/mL)+孕酮(1 μg/mL)+轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 μg/mL)+胰島素(5 μg/mL)+L-谷氨酰胺(292 μg/mL)+EGF (10 ng/mL)，其中FBS、EGF、DMEM/F12為Hyclone公司產(chǎn)品，其余添加因子均為Sigma公司產(chǎn)品;卡那霉素為北京索萊寶生物有限公司產(chǎn)品;兔抗人的熒光單克隆抗體keratin 8為北京萊茲生物公司產(chǎn)品; LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;mIL-17定量ELISA試劑為eBioscience公司產(chǎn)品.

1.3 bIL-17基因引物設計

從GenBank中查找下載牛的bIL-17基因序列，由MEGA 4.0分析軟件對序列進行分析，閱讀其框架，選取具有功能的540 bp片段，根據(jù)引物設計原則設計1對引物：上游引物5'-GCGAATTCCTCACAGCGAGCACAAGT-3';下游引物5'-CCCTCGAGTAGGGGTCAGGCAGAAAG-3'，分別在上下游引物中設計了EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點.

1.4 bIL-17基因克隆

根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明，從牛脾臟提取組織總RNA.按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明以總RNA為模板，進行RT-PCR反應合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板進行PCR反應：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，加入5 μL10×Reaction buffer，4 μL dNTP混合物(2.5 mmol/L)，1 μL Pyrobest DNA聚合酶(2 U/μL)，上、下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積50 μL.循環(huán)條件：94℃5 min;94℃30 s、64℃30 s、72℃30 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min.10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并按回收試劑盒說明對產(chǎn)物純化回收.

1.5 PCR擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物連于pMD19-T vector：pMD19-T vector 1 μL、純化bIL-17 4 μL、SolutionⅠ5 μL，16℃條件下反應2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，37℃條件下培養(yǎng)過夜，挑取轉(zhuǎn)化生長的陽性菌落，應用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，對其進行鑒定.將鑒定含有陽性質(zhì)粒的菌液送往上海生物工程公司進行序列測定.

1.6 pEGFP-N3-bIL-17重組真核表達載體的構建

用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pMD19-T-bIL-17質(zhì)粒，回收bIL-17片段，將回收片段定向插入用同法酶切的pEGFP-N3載體啟動子下游，得到重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17，構建過程見圖1.

圖1 pEGFP-N3-bIL-17構建示意圖Fig.1 The schematic diagram of pEGFP-N3-bIL-17 plasmid construction

1.7 pEGFP-N3-bIL-17重組真核表達載體的鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliDH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，對重組質(zhì)粒進行PCR及EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確后將菌液送至上海生物工程公司進一步測序鑒定.

1.8 乳汁中乳腺上皮細胞的分離、培養(yǎng)

用無菌水清洗牛乳房，乙醇消毒后，手擠牛乳于滅菌的藍蓋瓶中，放于盛有37℃溫水的保溫盒中帶回實驗室.將200 mL乳汁與含雙抗的PBS按體積比2∶1混合后，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 500 r/min離心20 min，小心吸取細胞層，加入5 mL完全培養(yǎng)液，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液，之后每3 d換1次液，待細胞長出單克隆后原瓶消化，待長至80%匯集時傳代培養(yǎng)，凍存第3代細胞.

1.9 牛乳腺上皮細胞的鑒定

采用免疫組化方法檢測培養(yǎng)的細胞角蛋白8的表達：將細胞復蘇后，于常溫下用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定生長于24孔板中的細胞30 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入體積分數(shù)為0.2%的TritonX-100通透處理5 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入PBS稀釋10倍的正常山羊血清封閉處理30 min;加兔抗人的細胞角蛋白8多克隆抗體(體積比1∶100稀釋)于37℃條件下振蕩孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min;加入FITC標記的山羊抗兔IgG (體積比1∶50稀釋)，室溫下避光振蕩孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入DAPI使用液(10 μg/mL)，室溫避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結果，同時以牛成纖維細胞作陰性對照.

1.10 真核表達載體pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞

將pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，取菌液50 μL接種到50 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上振蕩過夜.按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書方法提取并純化質(zhì)粒DNA.將凍存的乳腺上皮細胞復蘇到6孔板中，每孔接種5×104個細胞，待細胞匯合度為70%時，用DMEM-F-12培養(yǎng)基對細胞進行6 h饑餓處理.處理后，將4 μg重組質(zhì)粒、5 μL PLUSTM Reagents加入到500 μL DMEM-F-12培養(yǎng)基中輕輕混勻，室溫靜置5 min后加入8 μL LipofectamineLTX，輕輕混勻并室溫靜置30 min.用PBS洗孔板中細胞，每孔加2 mL，洗3次，將轉(zhuǎn)染液加入到6孔板中，細胞放置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱孵育6 h，去除轉(zhuǎn)染復合物并加入含F(xiàn)BS(體積分數(shù)為10%)的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24～48 h，在488 nm波長激發(fā)光下，應用熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況.

1.11 RT-PCR法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞后bIL-17基因的表達

收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的乳腺上皮細胞(1.5×106個/mL)，按RNAiso Plus試劑法提取組織總RNA，并以它為模板進行RT-PCR，擴增bIL-17，其方法同1.4.

1.12 定量ELISA法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞后bIL-17基因的表達

根據(jù)IL-17定量ELISA試劑盒說明書進行.用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定樣品中bIL-17表達水平.設置4組，分別為IL-17標準品組、牛乳腺上皮細胞組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒組.用IL-17一抗包被96孔板，4℃條件下過夜孵育后，緩沖液洗板;使用緩沖液倍比稀釋IL-17A標準品，加入96孔板，每孔100 μL，剩余3組收集細胞培養(yǎng)上清，12 000 r/min離心40 min，每孔加入100 μL上清液，4℃條件下過夜孵育后洗板;加入IL-17二抗，室溫孵育1 h后洗板;加入辣根過氧化物酶標記的生物素(Avidin-HRP*)室溫孵育30 min后洗板;加入顯色劑室溫孵育15 min后洗板;最后加入終止液，室溫孵育15 min;酶標儀檢測各孔D450nm值，繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線計算bIL-17基因的蛋白表達量.最后通過t檢驗方法分析轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組細胞表達IL-17蛋白的差異.

2 結果

2.1 bIL-17基因片段擴增

用所設計的引物，從牛脾臟中擴增出大約為540 bp基因片段，其與預期目的片段大小相符，結果如圖2所示.

圖2 bL-17基因的RT-PCR擴增凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of bovine IL-17 gene amplified by RT-PCR

2.2 bIL-17基因片段與pMD19-T質(zhì)粒連接和重組質(zhì)粒的鑒定

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶與pMD19-T質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，隨機挑選出陽性重組菌落進行擴增培養(yǎng)，用PCR法擴增出約540 bp的bIL-17基因片段;同樣用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒也可分離到540 bp的基因片段和開環(huán)質(zhì)粒pMD19-T，結果見圖3a.測序及Blast分析顯示與GenBank中的序列完全相同(登錄號：NM_018865)，測序結果圖略.

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17酶切鑒定

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶與pEGFPN3質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，隨機挑選出陽性重組子菌落進行擴增培養(yǎng)，用PCR法擴增出約540 bp的bIL-17基因片段;同樣用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒也可分離到540 bp的基因片段和開環(huán)質(zhì)粒pEGFP-N3(4.7 kb)，測序及Blast分析顯示bIL-17基因已經(jīng)成功插入到pEGFP-N3載體.結果見圖3b.

2.4 牛奶中乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)

新鮮牛奶離心獲得的細胞接種3 d后，均可見許多鵝卵石樣細胞聚集生長形成的克隆，以及分散生長的呈梭形的單個細胞，同時還可見少量的吞噬細胞(圖4A、4B);每3 d換液，繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，形成許多大的、生長均勻的單細胞克隆，呈現(xiàn)鵝卵石狀和多角形2種形態(tài)(圖4C、4D)，在細胞克隆的表面可觀察到分泌到胞外的乳滴(圖4E)，同時觀察到大量吞噬細胞轉(zhuǎn)移到乳滴中(圖4F).原瓶消化使細胞分散，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，細胞在瓶底80%匯集，吞噬細胞消失，形成均勻的多角形和鵝卵石狀細胞混合生長的乳腺上皮細胞層(圖4G).細胞傳至第3代時將其凍存，復蘇后存活率高達90%，如圖4H所示.

圖3 pMD19-T-bIL-17(a)、pEGFP-N3-bIL-17(b)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pMD19-T-bIL-17(a)and pEGFP-N3-bIL-17(b)digested by double-enzyme cleavage methed

圖4 乳汁中分離培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞形態(tài)(100×)Fig.4 The picture of the cultured bovine mammary epithelial cells from milk(100×)

2.5 原代牛乳腺上皮細胞的鑒定

應用免疫熒光細胞染色法檢測純化牛乳腺上皮細胞的骨架蛋白——角蛋白8的表達情況，結果顯示，從牛乳中分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞角蛋白8表達呈陽性(圖5).圖中綠色熒光為表達于細胞質(zhì)中的角蛋白8，藍色部分為DAPI染色的細胞核，進一步在蛋白水平上證明分離培養(yǎng)的細胞是乳腺上皮來源.

圖5 免疫熒光細胞染色鑒定角蛋白8表達(100×)Fig.5 Keratin 8 expression identified by the immunohistochemistry assay(100×)

2.6 真核表達載體pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞

重組pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察到約20%的細胞有梭形或圓形的綠色熒光(圖6)，證實重組質(zhì)粒pEGFPN3-bIL-17能有效轉(zhuǎn)染至牛乳腺上皮細胞并在細胞中表達.

2.7 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17在牛乳腺上皮細胞中的表達

重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞48 h后，采用RT-PCR方法對外源bIL-17基因的表達進行鑒定，結果(圖7)顯示，重組質(zhì)粒pEGFPN3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞組在約540 bp處出現(xiàn)bIL-17基因目的條帶，而未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組都沒有檢測到bIL-17基因目的條帶，證實重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染細胞后，外源bIL-17基因可以獲得很好地轉(zhuǎn)錄.

圖6 熒光顯微鏡下觀察pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞(100×)Fig.6 Detection of GFP expression in bovine mammary epithelial cells by fluorescence microscope(100×)

圖7 RT-PCR檢測bIL-17基因在轉(zhuǎn)染乳腺上皮細胞中的表達Fig.7 The bIL-17 expression in the transfected bovine mammary epithelial cells detected by RT-PCR

2.8 真核載體pEGFP-N3-bIL17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞后bIL-17蛋白表達水平ELISA檢測結果

為進一步驗證重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞后bIL-17基因是否表達，我們應用定量ELISA的方法對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17的牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液上清中bIL-17蛋白量進行了檢測，結果如圖8所示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒牛乳腺上皮細胞組bIL-17蛋白含量高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細胞組(t-檢驗，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組bIL-17蛋白含量與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組基本無差異.

圖8 ELISA法檢測bIL-17基因在轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞中的蛋白表達量Fig.8 The protein expression of bIL-17 in the transfected bovine mammary epithelial cells detected by ELISA

3 討論

乳腺上皮細胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞作為一種模型，既可用來研究乳蛋白基因表達［9］，又可作為乳腺特異性表達載體的檢測系統(tǒng)［10］，因此被廣泛應用于乳蛋白基因表達及調(diào)控、細胞形態(tài)學及乳腺生物反應器的基礎理論研究.另外，在乳腺炎的發(fā)病過程中，乳腺上皮細胞是病原菌在穿過乳頭末端的機械屏障后進入機體內(nèi)部之前最先接觸的細胞，多種病原菌侵入乳腺后可通過各種方式黏附和侵入牛乳腺上皮細胞，因此，乳腺上皮細胞亦是體外研究乳腺炎發(fā)病機制和動物基因治療的理想模型［11-14］，此外，牛乳中乳腺上皮細胞來源廣泛，易于取材，可以分離培養(yǎng)，易于接受外源基因尤其是質(zhì)粒DNA，并能穩(wěn)定表達對應的基因產(chǎn)物，因此在動物基因治療方面亦有良好的應用前景.IL-17由CD4+T細胞中的Th17細胞，單核細胞等分泌，最初被命名為細胞毒T淋巴細胞抗原8(CTLA-8)，是一種促炎性細胞因子.有研究顯示hIL-17可以刺激表皮成纖維細胞、滑膜細胞、內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞分泌IL-6和IL-8［15］.大量證據(jù)表明，IL-17具有強大的促炎作用和抗感染作用.在防御革蘭陰性細菌如肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae及脆弱類桿菌Bacterookdes fragilis等的感染中，可在感染早期募集中性粒細胞，通過刺激上皮細胞分泌IL-8、G-CSF等細胞因子誘導刺激樹突狀細胞等免疫細胞的成熟分化，從而加強局部炎癥反應，加強機體清除細胞外感染的細菌，防止慢性感染和組織化膿發(fā)生［16-18］.IL-17還通過刺激IL-6和PGE2的產(chǎn)生，加強局部炎癥反應，誘導細胞間黏附因子(ICAM)產(chǎn)生，協(xié)同促進T細胞反應［19］，從而在非特異性免疫和特異性免疫之間建立聯(lián)系.因此，對IL-17在乳腺炎發(fā)病中作用的深入研究，可能為解決乳腺炎發(fā)病機制尚未解決的問題帶來新的希望.

本研究采用RT-PCR方法從牛脾臟中擴增獲得牛IL-17基因編碼序列，并將其插入到真核表達載體pEGFP-N3中.用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞，獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染pEGFPN3-bIL-17之后可以檢測到外源IL-17獲得了高效表達.以牛乳腺上皮細胞作為靶細胞結合IL-17基因轉(zhuǎn)染技術的進一步研究，可能為后續(xù)奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎基因防治以及抗病轉(zhuǎn)基因奶牛的研究奠定基礎.

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【責任編輯李曉卉】

Construction of bovine interleukin-17 eukaryotic expression vector and its expression in the bovine primary mammary epithelial cells

WANG Ting，CUI Xinjie，LIU Bingchun，TAO Lin，HU Qingliang，XIU Lei，WANG Xiao
(College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，China)

【Objective】To construct bovine interleukin-17(bIL-17)gene eukaryotic expression vector and detect its expression in bovine mammarily epithelial cells which were primarily culturedin vitro.【Method】Bovine interleukin-17 gene(bIL-17)was amplified from the spleen tissue of cow by RT-PCR，which was inserted into pMD19-T vector and then sequenced.ThebIL-17 was inserted into an expression vector pEGFP-N3 carrying the enhanced green fluorescent protein to generate a new plasmid pEGFP-N3-bIL-17.The pEGFP-N3-bIL-17 eukaryotic expression vector was transfected into bovine primary mammary epithelial cells with LipofectamineTM2000 liposome.After the transfection，the green fluorescent protein was observed under fluorescence microscopy，andbIL-17 transcription was examined by RT-PCR and bIL-17 protein expression in cells detected by ELISA methods.【Result and conclusion】The recombinant vector pEGFP-N3-bIL-17 with a green fluorescence and neomycin resistance was constructed and bIL-17 protein could be normally expressed in mammary epithelial cells.

bovine interleukin-17(bIL-17);vector construction;bovine primary mammary epithelial cell;transfection;expression

S852.42

A

1001-411X(2014)01-0079-07

王婷，崔新潔，劉秉春，等.牛白細胞介素-17真核表達載體的構建及在牛乳腺上皮細胞中的表達［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35(1)：79-85.

2013-02-04優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1459.002.html

王婷(1990—)，女，碩士研究生，E-mail:fenziwang90@gmail.com;通信作者:王瀟(1978—)，男，副教授，博士，E-mail:wxiao1978@yahoo.com.cn

國家自然科學基金(30901066);內(nèi)蒙古自然科學基金(2010MS0514)