廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)野生大豆自然居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

趙青松，趙云云，馬啟彬，年海，楊存義

(1亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)和利用國家重點實驗室/國家大豆改良中心廣東分中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州 510642;2河北農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050031)

廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)野生大豆自然居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

趙青松1，2，趙云云1，馬啟彬1，年海1，楊存義1

(1亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)和利用國家重點實驗室/國家大豆改良中心廣東分中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州 510642;2河北農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050031)

【目的】粵北山區(qū)的野生大豆是全世界分布最南端的野生大豆自然居群，本研究對來源于廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)的一個自然居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，為該自然居群的原位保護(hù)和異位保護(hù)提供理論依據(jù).【方法】在廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)的1個野生大豆自然居群中根據(jù)地形等距離采集了98株野生大豆樣本，分別用22和73對微衛(wèi)星(SSR)引物對其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析.【結(jié)果和結(jié)論】在98個樣品中分別檢測到27和85個等位變異，平均位點等位變異數(shù)分別為1.23和1.02個，居群期望雜合度(He)平均為0.02.聚類結(jié)果表明，可將居群分為3個部分，沿坪乳公路兩側(cè)分布的野生大豆表現(xiàn)出相對較高的遺傳多樣性.綜合各指標(biāo)表明，廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)居群的遺傳多樣性較低，在保護(hù)和利用時選取部分單株即可代表該群體;在對居群遺傳多樣性初步評價時，用均勻分布的30對引物即可.

野生大豆;遺傳多樣性;自然居群;SSR標(biāo)記;廣東乳源縣

一年生野生大豆Glycine sojaSieb.et Zucc.是栽培大豆的近緣祖先種，比栽培大豆的遺傳多樣性高［1-2］.野生大豆群體中所蘊(yùn)含的優(yōu)良基因為栽培大豆改良提供了重要的基因資源，目前已從野生大豆群體中篩選出高異黃酮［3］、抗旱［4］、抗大豆花葉病毒［5］、抗大豆包囊線蟲［6］、抗銹［7］、耐鹽［8］、高蛋白［9］、油分特異［10］等珍貴種質(zhì)，并成功利用野生大豆資源改良大豆［11］.野生大豆資源是寶貴財富，但由于人口激增、人類活動和生態(tài)環(huán)境變化等多種原因，導(dǎo)致野生大豆的分布面積正在逐漸減小，生境碎片化乃至消失［12］.野生大豆的保護(hù)迫在眉睫，了解群體的遺傳結(jié)構(gòu)是制定合理的取樣策略、確定原地保存或異地保存的前提.

野生大豆主要分布在中國、日本、朝鮮半島和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，我國境內(nèi)除青海、新疆及海南3省外，北起53°N的黑龍江省塔河縣，南至24°N的廣西象州均有分布［13］.然而各省所搜集和研究的野生大豆數(shù)量差異很大，編目入國家長期庫保存的8 515余份野生大豆資源，南方各省所占比例不到8%，其中來自廣東省的僅有16份［14］.蓋鈞鎰等［15］對全國栽培大豆不同地理、季節(jié)生態(tài)類型和一年生野生大豆不同地理生態(tài)類型大量材料的等位酶、細(xì)胞器、DNA、RFLP等不受人工選擇直接影響的中性性狀分析發(fā)現(xiàn)，南方原始野生大豆可能是各地栽培大豆的共同祖先，南方原始栽培類型在向北方擴(kuò)展過程中不斷演化出各種早熟類型.董英山等［16］根據(jù)《中國野生大豆資源目錄》中記載的13個性狀數(shù)據(jù)分析了6 172份野生大豆資源遺傳多樣性、綜合變異系數(shù)和地理分布，認(rèn)為東南沿海是中國3個野生大豆起源中心之一.Wen等［17］調(diào)查了196個來自中國的野生大豆的8個形態(tài)性狀和60個SSR位點的變異發(fā)現(xiàn)，華南野生大豆多樣性最高.因此有必要對南方野生大豆做深入調(diào)查，為野生大豆資源保護(hù)和利用提供依據(jù).

全國大豆考查組于20世紀(jì)80年代對全國野生大豆進(jìn)行了考察，認(rèn)為全國野生大豆分布的南端在廣東和廣西.對廣東省野生大豆的表型性狀已有描述［18］，從分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性的分析散布在全國群體的分析中，例如徐立恒等［19］分析了來自全國8個群體時發(fā)現(xiàn)，廣東英德一個野生大豆居群具有較高的遺傳多樣性.本研究在對廣東省乳源縣大橋鎮(zhèn)的一個野生大豆的植物學(xué)性狀和生境進(jìn)行調(diào)查的基礎(chǔ)上，收集了98份野生大豆的葉子，采用SSR分子標(biāo)記分析其遺傳多樣性，旨在更加全面地了解廣東野生大豆遺傳多樣性，為廣東省野生大豆的保護(hù)和利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

在廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)坪乳公路邊發(fā)現(xiàn)一個野生大豆自然居群，在野生大豆居群中采集98份材料的葉子，將葉子裝入自封袋內(nèi)，放到隨身攜帶的冰盒內(nèi)，帶回實驗室置于-80℃冰箱中備用.取樣方法采用居群內(nèi)隨機(jī)取樣，根據(jù)各居群內(nèi)野生大豆的分布密度不同，取樣點間距五至幾十米不等(圖1).

1.2 SSR引物

參照Cregan等［20］建立的大豆分子標(biāo)記連鎖圖，從每個連鎖群上等距離選擇3～4個SSR位點，其引物序列來源于美國農(nóng)業(yè)部大豆基因組數(shù)據(jù)庫(http：∥129.186.26.94/SSR.html)，共計73對引物(表1).引物由上海生物技術(shù)有限公司合成.

1.3 DNA提取

取野生大豆葉片約4 cm2放入2 mL離心管中，加入800 μL微量抽提液，用打樣機(jī)打碎.65℃水浴30 min;加氯仿+異戊醇+乙醇(體積比為76∶4∶20)的混合液800 μL，搖10 min;12 000 r/min離心5 min.取上清液，加1/10體積的3 mol/L乙酸鈉(約80 μL)，再加等體積(約800 μL)的異丙醇，搖3～5 min.12 000 r/min離心5 min，去上清液，加φ為75%乙醇溶液500 μL洗DNA沉淀2次，風(fēng)干.加100 μL 1×TE(含RNaseA)溶解，放-20℃冰箱內(nèi)保存.

1.4 PCR擴(kuò)增及檢測

PCR反應(yīng)體系：2.0 μL的10×PCR Buffer(含Mg2+)，0.2 μL的dNTP(10 mmol/L)，0.2 μL的Taq酶(5 U/μL)，1 μL模板DNA(約50 ng)，0.12 μL的SSR Primer(50 μmol/L)，雙蒸水補(bǔ)至20 μL.PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min;94℃30 s，50℃30 s，72℃25 s，30個循環(huán);72℃延伸5 min.反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液，60 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后記錄條帶.

圖1 廣東乳源野生大豆采樣分布圖Fig.1 The distribution of samples of wild soybean in Ruyuan County of Guangdong Province

表1 本試驗所采用的SSR引物Tab.1 The list of SSR primers used in this experiment

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)每個SSR標(biāo)記的等位變異有無進(jìn)行賦值，有帶記為l，無帶記為 0;并將0、1矩陣轉(zhuǎn)化為基因型數(shù)據(jù)：純合個體用2個相同的字母表示，如AA、ZZ等，雜合個體用2個不同的字母表示，如用AZ表示.等位基因數(shù)、期望雜合度、實測雜合度、有效等位變異數(shù)、Shannon指數(shù)(I)用Peakall等［21］編寫的Gene-AlEx 6.5計算，用NTSYSC2.1軟件進(jìn)行聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大豆地理分布、生境及生物學(xué)特性描述

廣東省乳源縣野生大豆主要分布在大橋鎮(zhèn)附近坪乳公路的兩側(cè)，分布范圍大約2萬m2，不連續(xù)分布，總體呈長方形.公路的東側(cè)主要為稻田，野生大豆主要著生在田埂、水溝旁等地方.坪乳公路西側(cè)有一條機(jī)耕小路，野生大豆主要著生在這兩條路旁邊及周圍.野生大豆多與主干明顯的植物伴生在一起，也有一些野生大豆匍匐于地面，但長勢較弱;多分布在水源充足的地方，干旱地方較少分布，近水源野生大豆植株高大，葉片肥厚，干旱地方野生大豆植株矮小.從表型性狀看，野生大豆葉片的形狀有卵圓形、橢圓形、披針形等，有同株異形葉現(xiàn)象，葉的大小差異很大，花較小，紫色或淡紫色，莖為青色或淡紫色，莖上多披絨毛，莖的形狀方形或圓形.

2.2 基于22對引物遺傳多樣性分析

首先利用分布在20個大豆連鎖群上的22對SSR引物對乳源大橋鎮(zhèn)自然群體取得的樣本進(jìn)行分析，結(jié)果見表2和表3.發(fā)現(xiàn)在5個位點上出現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性位點為22.73%，等位基因在居群中的分布頻率不均(表2).22對引物共擴(kuò)增出27條帶，平均每個位點擴(kuò)增出1.23個位點，大部分引物擴(kuò)增出1條帶，因此多樣性指標(biāo)均比較低(表3)，說明乳源野生大豆居群的遺傳多樣性較為單一.

2.3 基于22對引物的聚類分析

首先根據(jù)每對引物擴(kuò)增出的帶型將所有個體分為9組，每組內(nèi)個體在22對SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物帶型一致(表4).然后從每組中選1個個體作為代表進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果見圖2.在相似系數(shù)為約為0.8處可將野生大豆分為3類：第1類以RY001、RY073、RY074、RY049為代表，包括84個材料;第2類包括RY033和RY038共2份材料;第3類以RY005、RY027、RY079為代表，包括12份材料.從分布空間上看，第1類主要分布于田間地頭，后2類主要分布于乳坪公路兩側(cè).

表2 多態(tài)性位點等位基因分布頻率Tab.2 Frequency of alleles of polymorphism loci

表3 各SSR位點主要遺傳多樣性Tab.3 The genetic diversity at SSR loci

2.4 基于73對引物對乳源野生大豆遺傳多樣性的分析

為了了解更多位點的遺傳結(jié)構(gòu)，從20個連鎖群上均勻選擇73對SSR引物進(jìn)一步分析該群體的遺傳多樣性.結(jié)果表明，平均位點多態(tài)率為16.44%，73個位點共檢測到85個等位基因變異，等位基因數(shù)目范圍為1～2個，其中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的有12對引物，分別為Satt045、Satt419、Satt135、Satt020、Sat_ 099、Satt530、Satt539、Satt556、Satt301、Satt073、Satt239和Satt277，而其他引物對在群體內(nèi)僅擴(kuò)出1條帶.平均有效等位基因數(shù)為1.02，Shannon指數(shù)(I)0.04，期望雜合度為0.02.

表4 基于SSR結(jié)果的個體分組Tab.4 The merged individuals by SSR

圖2 基于22對引物乳源野生大豆居群聚類圖Fig.2 The cluster class diagram of wild soybean in Ruyuan

22對引物所獲得的主要指標(biāo)與73對引物所獲得的主要指標(biāo)比較發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)間相似，無明顯差異(表5)，說明乳源野生大豆遺傳多樣性比較單一，對于遺傳結(jié)構(gòu)單一的乳源群體，只要用22對引物即可以評價其遺傳多樣性水平.

表522 對和73對引物主要遺傳多樣性指標(biāo)Tab.5 The main genetic diversity index of 22 and 73 pairs of primers

3 討論與結(jié)論

乳源縣大橋鎮(zhèn)野生大豆自然居群分布于坪乳公路兩側(cè)的路邊、土埂、水溝等水源充足的地方，這和前人描述的野生大豆生境相似［18］.調(diào)查發(fā)現(xiàn)該群體個體間葉片大小與生境環(huán)境密切相關(guān)，分布在水源充足的野生大豆植株高大，葉片亦較大;而分布在干旱瘠薄地方的野生大豆則葉片較小.野生大豆的葉形、花色、種子形狀及顏色、種子大小、茸毛疏密程度、茸毛顏色等性狀等均存在不同程度的變異.乳源大豆葉片的形狀有卵圓形、橢圓形、披針形等，花較小，紫色或淡紫色，莖為青色或淡紫色，莖上多披絨毛，莖的形狀方形或圓形.

中國野生大豆分布廣泛，來自不同地區(qū)的野生大豆多樣性呈現(xiàn)明顯的地域性，南方群體最高，黃淮海群體次之，東北群體最低［17］.目前多樣性研究多集中在全球范圍［22-23］或全國范圍［24］的大尺度研究，這些研究為從整體上揭示野生大豆的分化提供了證據(jù)，而小區(qū)域或單一自然居群的研究卻可從微進(jìn)化角度提供數(shù)據(jù).本研究利用SSR標(biāo)記對廣東乳源1個野生大豆居群進(jìn)行了多樣性分析，73個位點檢測出85個等位變異，平均每個位點有1.02個多態(tài)性帶，低于江西省野生大豆(7.2個)［25］、湖南新田野生大豆居群(5.4個)［26］、吉林省龍井野生大豆保護(hù)區(qū)(4.29個)［27］.乳源野生大豆居群遺傳多樣性較低，推測此處野生大豆是由于人類活動從其他地方帶來的少數(shù)野生大豆種子繁衍形成的群體.乳源野生大豆分為3類，結(jié)合采樣點分析發(fā)現(xiàn)，此居群中沒有差異的一類(共包括84份材料)分布在田間，而其他2類主要沿坪乳公路兩側(cè)分布.由此推斷此處野生大豆居群形成時間較短，遺傳多樣性較低.

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【責(zé)任編輯周志紅】

Genetic analysis of wild soybean papulations growing in Daqiao Town of Ruyuan County，Guangdong Province

ZHAO Qingsong1，2，ZHAO Yunyun1，MA Qibin1，NIAN Hai1，YANG Cunyi1
(1 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/ Guangdong Sub-center of National Soybean Improvement Center/College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;2 Institute of Cereal＆Oil Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050031，China)

【Objective】The natural wild soybean populations distributing in the north of Guangdong are the extreme southern limit in the world.The objective of the present study was to explore the genetic characteristics of one natural wild soybean population from Daqiao Town of Ruyuan County in Guangdong Province，providing the base forin situorex situconservation for this population.【Method】Ninety-eight wild soybean samples were collected from one natural population of wild soybean growing in Ruyuan County，Guangdong Province.In order to facilitate the selection of the natural reserve of wild soybean，genetic diversity of this population was evaluated using 22 and 73 SSR makers.【Result and conclusion】The results showed that 27 and 85 alleles were detected with an average of 1.23 and 1.02 alleles per marker respectively.Expected heterozygosity(He)was 0.02 averagely.The cluster analysis showed that the population could be divided into three subgroups.The population distributing along both sides of Pinru road showed a higher genetic diversity.The above analysis indicated that the genetic diversity ofthis population was very low.Thirty selected SSR markers may clarify the primary evaluation of genetic diversity population.

wild soybean;genetic diversity;natural population;SSR marker;Ruyuan County of Guangdong Province

S336

A

1001-411X(2014)01-0037-06

趙青松，趙云云，馬啟彬，等.廣東乳源縣大橋鎮(zhèn)野生大豆自然居群遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(1)：37-42.

2013-02-21優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.007.html

趙青松(1975—)，男，碩士，E-mail:zhaoqingsonga@163.com;通信作者:楊存義(1966—)，男，副教授，博士，E-mail:ycy@scau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(30771364);廣東省農(nóng)業(yè)科技團(tuán)隊項目(2011A020102010)