響應(yīng)面曲線法優(yōu)化超聲輔助茶多酚提取工藝研究

陶阿麗，余大群

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

響應(yīng)面方法 ( Response Surface Methodology，RSM )是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。 隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，它已成為精度高、應(yīng)用廣并具有實(shí)用價(jià)值的優(yōu)化技術(shù)[1]。采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝過(guò)程主要涉及3步:試驗(yàn)設(shè)計(jì)——建立數(shù)學(xué)模型評(píng)估相關(guān)性——預(yù)測(cè)響應(yīng)值考察模型的準(zhǔn)確性[2]。

茶多酚( Tea Polyphenol，TP) 是茶葉中的有效成分，又名茶單寧、茶鞣質(zhì)，茶多酚由約30 多種含酚基的物質(zhì)組成，是茶葉中所含的多羥基酚類化合物的總稱。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚抗氧化性能比維生素的抗氧化效價(jià)高1倍，而且無(wú)毒，因此是一種理想的食品天然抗氧化劑。茶多酚還具有抗癌治病、防衰老、抗輻射、消除人體自由基、降血糖、防治心血管疾病、抑菌抑酶、沉淀重金屬等一系列特殊的藥理功能[3-6]。

由于超聲波輔助提取法操作簡(jiǎn)便、溶劑用量少，能夠較大限度地保留提取組分的天然活性，利用其產(chǎn)生的空化、機(jī)械擾動(dòng)等物理作用的原理，粉碎植物細(xì)胞壁使目標(biāo)物大量的浸出，故本研究采用超聲波技術(shù)輔助來(lái)提取茶多酚。同時(shí)，采用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)這幾個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以進(jìn)一步確定優(yōu)化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

試驗(yàn)所用茶葉采用綠茶黃山毛峰；試劑茶多酚純品、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乙酸乙酯、硫酸、氨水均為分析純。

主要儀器有721E型紫外分光光度計(jì)、KQ118超聲波清洗器、FA2004型電子天平、HH數(shù)顯恒溫水浴鍋、SHZ-D循環(huán)水式真空泵、DHG-9023型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、低速自動(dòng)平衡離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉的前處理

用研缽將茶葉碾碎，過(guò)60目篩備用。

1.2.2 超聲法提取茶多酚的單因素試驗(yàn)

(1)提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響 精密稱取1.000g茶葉末于燒杯中，加入20ml沸水，分別采用超聲提取10、20、30、40、50、60min，測(cè)定抽濾的濾液的光密度，計(jì)算茶多酚的提取率[7]。

(2)料液比對(duì)茶多酚提取率的影響 精密稱取1.000g茶葉末于燒杯中，按照料液比(g/ml)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35分別加入沸水，采用超聲提取40min，測(cè)定抽濾的濾液的光密度，計(jì)算茶多酚的提取率。

(3)提取次數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響 精密稱取1.000g茶葉末于燒杯中，加入30ml沸水，采用超聲提取40min，按上述方法反復(fù)提取5次，測(cè)定抽濾的濾液的光密度，計(jì)算茶多酚的提取率。

1.2.3 響應(yīng)面曲線優(yōu)化試驗(yàn)

以茶多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定范圍，應(yīng)用Design-Expert 7.1.6軟件，選取提取時(shí)間(A)、料液比(B)、提取次數(shù)(C)為考察因素，各因素設(shè)置3水平。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定茶多酚最佳提取工藝條件。

1.3 茶多酚的純化

沉淀茶多酚：準(zhǔn)確移取一定量茶多酚粗提液，在一定酸度條件下加入適量鈣鹽，離心分離，即得茶多酚-鈣鹽沉淀[8]。

沉淀轉(zhuǎn)溶：向茶多酚鈣鹽沉淀物中加入一定量的硫酸溶液，攪拌，并在一定溫度下放置，使之溶解。

乙酸乙酯萃?。簩⑥D(zhuǎn)溶后得到的清液，用適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取可進(jìn)一步純化茶多酚。最后在60℃真空干燥即得茶多酚成品。

1.4 茶多酚含量測(cè)定

采用酒石酸亞鐵比色法[9]測(cè)定茶多酚的含量,具體操作如下。

(1)按照文獻(xiàn)[10]的方法配制茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液、酒石酸亞鐵溶液以及pH7.5磷酸鹽緩沖液。

(2)分別精密移取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于25ml容量瓶中，加水4ml與5ml酒石酸亞鐵溶液充分混合，再加入pH7.5的緩沖溶液至刻度，用1cm比色皿，在波長(zhǎng)540nm處，以試液空白溶液做參比溶液，測(cè)定光密度。以茶多酚濃度為橫坐標(biāo)x，光密度為縱坐標(biāo)y，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)準(zhǔn)確稱取茶多酚提取液1ml，注入25ml容量瓶中，加水4ml，與5ml酒石酸亞鐵溶液充分混合，再加入pH7.5的緩沖溶液至刻度，用1cm比色皿，在波長(zhǎng)540nm處，以試液空白溶液做參比溶液，測(cè)定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茶多酚的提取率。

1.5 加樣回收率測(cè)定

精密移取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0ml分別于9只25ml容量瓶中，各加入精密吸取的樣品溶液1.0ml，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過(guò)程操作，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值，計(jì)算加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，其回歸方程為y=8.1575x+0.0383(R2=0.9990)，可知茶多酚濃度與光密度呈良好線性關(guān)系。

2.2 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，茶多酚的提取率發(fā)生先增后減的變化。在提取40min時(shí)茶多酚的提取率達(dá)到最高值，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)茶多酚提取率反而下降，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲提取導(dǎo)致茶多酚發(fā)生氧化所致[11]。

2.3 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比(g/ml)為1∶30時(shí)，茶多酚的提取率達(dá)到最高。

圖2 不同提取時(shí)間下的茶多酚提取率圖3 不同料液比下的茶多酚提取率

圖4 不同提取次數(shù)下的茶多酚提取率

水平因素料液比/(g/ml)提取時(shí)間/min提取次數(shù)11∶2535121∶3040231∶35453

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4 提取次數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，茶多酚的提取率先增后減。當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，茶多酚的提取率達(dá)到峰值，因此最佳提取次數(shù)為3次。

2.5 茶多酚提取的最佳條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取條件為料液比(g/ml)1∶25、1∶30、1∶35，提取時(shí)間35、40、45min，提取次數(shù)1、2、3次，作為自變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以茶多酚提取率為響應(yīng)值[12]，因素和水平取值如表1。

根據(jù) Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理[13]，設(shè)計(jì)了3因素 3水平共 17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)( 5個(gè)中心點(diǎn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)重復(fù) 2 次) 的響應(yīng)分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

響應(yīng)面分析方法的圖形是特定的響應(yīng)面對(duì)應(yīng)的因素A、B、C構(gòu)成的一個(gè)三維空間，可以直觀反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從試驗(yàn)所得的響應(yīng)分析圖上可以分析出它們之間的相互作用。從響應(yīng)面分析圖5、圖6、圖7中可以看出響應(yīng)值與3個(gè)影響因素料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)的關(guān)系。

綜合上述試驗(yàn)，采用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：

Y=18.98+0.82A+0.083B+3.70C-0.09AB-0.13AC+0.2BC-0.92A2-0.62B2-0.93C2，其中Y為提取率，A為料液比，B為提取時(shí)間，C為提取次數(shù)?；貧w方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 料液比與提取時(shí)間響應(yīng)圖圖6 料液比和提取次數(shù)響應(yīng)圖

圖7 提取時(shí)間和提取次數(shù)響應(yīng)圖

由表3可知，模型P<0.05，回歸方程具有顯著性，由響應(yīng)面分析法對(duì)茶多酚提取率的ANOVA分析結(jié)果可以得出，液料比(A)、提取次數(shù)(C)對(duì)茶多酚的提取率有顯著影響，而提取時(shí)間(B)則無(wú)顯著影響。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析得，最佳提取工藝條件為提取時(shí)間40.99min、料液比(g/ml)1∶31.84、提取次數(shù)為3次。在此條件下綠茶中茶多酚的提取率為21.91%。

2.6 加樣回收率測(cè)定

將綠茶中提取液稀釋后測(cè)定其光密度，并計(jì)算稀釋后茶多酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面分析法對(duì)茶多酚提取率的ANOVA分析結(jié)果

表4 綠茶提取物中茶多酚的含量

以茶多酚純品為標(biāo)準(zhǔn),測(cè)定綠茶提取液中茶多酚的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

加樣回收率的RSD為0.59%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定，方法可靠[14]。

3 結(jié)論

本研究以水溶液做溶劑，超聲輔助提取茶葉中的多酚類物質(zhì)，在確定了最佳工藝條件后，根據(jù)單因素試驗(yàn)得出影響茶多酚提取率的各因素的范圍，據(jù)此進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，由響應(yīng)面分析法對(duì)茶多酚提取率的ANOVA分析結(jié)果得出，料液比和提取次數(shù)的影響尤為顯著，根據(jù)單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步確定了茶多酚提取的最佳工藝條件為:料液比(g/ml)為1∶31.84，提取時(shí)間 40.99min ，提取次數(shù) 3 次。

[參考文獻(xiàn)]

[1]慕運(yùn)動(dòng).響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào),2001,22(3):91-94.

[2]Ashima V，Nathalie G.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production byPichiaanomala[J].Process Biochemistry，2002，37:999-1004.

[3]宋冠群，林金明.茶多酚分析方法研究與進(jìn)展[J].世界科技研究與發(fā)展,2004,26(1):41-51.

[4]Wiley B，Sun Y G，Xia Y N.Synthesis of Silver Nanostructures with Controlled Shapes and Properties [J].Acc Chem Res,2007,40:1067-1076.

[5]Sakanaka S,Aizawa M，Kim M.Inhibitory efforts of green tea polyphenols on growth and cellular adherence of an oral bacterium [J].Biosci Biotechnol Biochem，1996，60:745 - 749.

[6]Rai M，Yadav A，Gade A.Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.[J].Biotechnol Adv,2009,27:76-83.

[7]徐芳,趙春,張雪輝,等.沱茶中茶多酚水提取工藝研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,(8):145-147.

[8]劉煥云，李慧荔，邵偉雄,等.綠茶中茶多酚的提取工藝研究[J].山西食品工業(yè),2004,(2):23-25.

[9]曾光遠(yuǎn),王飛．影響酒石酸鐵比色法測(cè)定結(jié)果的因素[J].食品質(zhì)量安全與檢測(cè),2008,(Z1):67-69.

[10]李春燕,成浩,楊曉麗,等.單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在茶多酚水提取工藝研究中的應(yīng)用[J].昭通師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2012,(5):11-12.

[11]劉佳,焦士蓉,唐遠(yuǎn)謀,等．苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性[J].食品科學(xué),2011,(14):134-138.

[12]劉渠道,王建中,許諾.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取茶多酚的工藝研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2008,(9):42-44.

[13]BOX G E P,HUNTER W G.Statistics for experiments：An introduction to design，data analysis and model building [M].New York：John Wiley & Sons Inc,1978.

[14]隋煥平，夏薇,張玉梅.芹菜提取物中總黃酮含量測(cè)定[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2001,(4):332-333.