PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中突變的研究

袁鵬飛，汪建光，張麗柯，靳高遠，劉德純

PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中突變的研究

袁鵬飛，汪建光，張麗柯，靳高遠，劉德純

目的探討PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中突變的關(guān)系。方法選取200例乳腺癌患者組織標本，其中l(wèi)uminal A、luminal B、HER-2過表達型、besal-like型各50例。提取DNA，用紫外光分光光度儀來測定濃度及含量， 對exon9及exon20進行PCR擴增 ，擴增產(chǎn)物純化后測序，另取20例乳腺腺病組織標本用作為對照，與基因庫序列對比分析其突變的情況。結(jié)果200例乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)突變64例，突變率32%，其中exon9突變26例(40%)，exon20突變38例(60%)，在乳腺癌分子亞型中：luminal A型中22例(44%)，luminal B型中16例(32%)，HER-2過表達型 20例(40%)，besal-like型6例(12%)，突變分布有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在20例良性對照組中均沒發(fā)現(xiàn)突變。PIK3CA基因突變與乳腺癌腫瘤患者腫瘤大小、年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)之間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中的突變有差異，與乳腺癌其他臨床病理特征之間無明顯相關(guān)性。

PIK3CA基因；突變；乳腺腫瘤

乳腺癌(breast cancer)是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，目前已成女性發(fā)病第一的惡性腫瘤[1]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中癌基因激活和抑癌基因失活導(dǎo)致細胞異常增殖是該過程的重要分子機制之一。

磷脂酰肌醇-3-激酶催化單位α(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic alpha,PIK3CA)PIK3CA基因突變通過PIK3/AKT信號通路與乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、肝癌、胃癌和骨髓異常增生綜合征等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[2，3]。本研究通過對乳腺癌組織中的PIK3CA基因外顯子9和外顯子20兩個突變區(qū)檢測,探討PIK3CA基因突變和乳腺癌臨床病理特征的聯(lián)系及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料從2012年至2013年河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科收集的原發(fā)性乳腺癌組織中挑選200例，其中l(wèi)uminal A型、luminal B型、HER-2過表達型、besal-like型各50例，標本均在切除后30 min內(nèi)放入液氮中，并存在-80℃超低溫冰箱中，年齡35～66歲，平均(50.5±10.20)歲，所有病例均經(jīng)病理科確診均為浸潤性導(dǎo)管癌并用免疫組織化學(xué)方法分型。另收集同期科內(nèi)乳腺腺病20例標本對照。

1.2DNA提取組織DNA抽取采用QIA GEN組織DNA抽提試劑盒，參照說明書標準步驟進行抽提。

1.3PCR擴增PIK3CA基因第9及20外顯子引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由上海英俊有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×Goldstar 10μL,滅菌蒸餾水6 μL，模版DNA 2 μL，引物2 μL，加樣體系20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4電泳PCR產(chǎn)物放置于Tanon power EPS 300 電泳儀110 V電壓，電流80 mA，電泳20 min。

1.5DNA測序PCR產(chǎn)物純化后在ABI 3730XL DNA測序儀上進行，由上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗所完成。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法分析PIK3CA基因突變的狀態(tài)與患者年齡關(guān)系用t檢驗，采用χ2檢驗分析PIK3CA基因突變與乳腺癌臨床病理特點的關(guān)系，統(tǒng)計處理均采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PIK3CA基因突變區(qū)域檢測結(jié)果PIK3CA基因的突變：200例乳腺癌組織中，PIK3CA基因突變64例(32%)，其中exon9突變26例(40%)，exon20突變38例(60%)，所有突變均為錯義突變。PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中的突變見表1。

2.2PIK3CA基因突變與患者臨床病理特征的關(guān)系PIK3CA基因突變與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、分化程度及p53表達等無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P>0.05)。

表1 PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亞型中的突變

注：PIK3CA基因在不同分子亞型中的突變有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.971,P<0.05)。

3 討論

PIK3CA基因是位于染色體3q26.3上的一段34 kb的基因，染色體由編碼1 068個氨基酸的20個外顯子組成，該組氨基酸產(chǎn)生一組長度為124 KD的蛋白構(gòu)成了ⅠA類PIK(磷酸肌醇3-激酶)的催化亞單位P110a，其主要功能是催化4，5-PIP2成為3，4，4-PIP3，而PIP3可作為第二信使結(jié)合并且激活多種細胞內(nèi)靶蛋白。2004年發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因在多種腫瘤中存在突變[4]，PIK3CA基因突變通過PI3K/AKT的途徑引發(fā)AKT持續(xù)活化，導(dǎo)致成纖維細胞和乳腺上皮細胞的生長和轉(zhuǎn)化，抑制細胞凋亡，與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系密切[5]。

研究表明，PIK3CA基因突變80%-90%聚集在該基因的第9外顯子和第20外顯子，分別對應(yīng)該酶的螺旋區(qū)和激酶區(qū)[6]。乳腺癌組織中PIK3CA基因突變頻率在8%～40%。研究證實PI3K通路的激活，無論是通過抑癌基因PTEN的失活還是癌基因PIK3CA的激活，都可引起乳腺癌患者對靶向藥物Herceptin的耐藥[7-8]。

本研究中l(wèi)uminal A型中22例(44%)，luminal B型中16例(32%)，Her-2過表達中20例(40%)，besal-like型中6例(12%)，在乳腺癌不同分子亞型中突變發(fā)生率不同，而在20例良性對照組中均沒發(fā)現(xiàn)突變。PIK3CA基因突變和ER表達相關(guān)[9-10]。Akt依賴性ER激活，提示ER陽性腫瘤選擇性生長[11]。然而，對內(nèi)分泌治療抵抗的PIK3CA基因突變?nèi)橄侔┗颊撸蛟S是PI3K抑制劑的敏感人群。本研究的結(jié)果證實了PIK3CA基因在乳腺癌組織中的存在突變，在乳腺癌不同分子亞型中有突變的差異，PIK3CA基因突變與乳腺癌臨床病理特征之間關(guān)系有待進一步研究。

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StudyofPIK3CAGeneMutationinDifferentMolecularSubtypesofBreastCancer

YUAN Peng-fei,WANG Jian-guang,ZHANG Li-ke,et al

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo investigate correlation ofPIK3CAgene mutation in different molecular subtypes of breast cancer.MethodsTo select 200 cases of breast cancer tissue samples,The luminal subtype A,luminal subtype B,HER-2 over-expression subtype and besal-like subtype all the 50 cases.To extract DNA from samples of breast cancer,PCR amplification of exons 9 and 20 was done after determining the concentration and content by ultraviolet spectrophotometer,followed by sequence after the product was purified.Another 20 samples of adenosis of breast were chosen as controls.ResultsThe frequency ofPIK3CAmutations among 200 cases was 64 missense mutations (32%),26(40%) in exon 9,38(60%) in exon 20 were found.In molecular subtype of breast cancer:22(44%) in luminal subtype A ,16(32%) in luminal subtype B,20(40%) in HER-2 over-expression subtype,6(12%) in besal-like subtype,mutations distribution had statistical significance(P<0.05).No mutation was found in 20 cases of adenosis of breast.The mutation ofPIK3CAgene had no significant correlation with age,tumor size and lymph node status(P>0.05).ConclusionThe mutations ofPIK3CAgene with different molecular subtypes are different in breast cancer.However,there is no significant correlation betweenPIK3CAgene mutations and the pathological features of breast carcinoma.

PIK3CAgene；mutation；breast neoplasms

2014-08-21

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

袁鵬飛(1987-)，男，河南洛陽人，碩士，從事腫瘤的基礎(chǔ)研究與臨床治療工作。

劉德純，男，教授，E-mail：liudechun2008@126.com

R737.9

A

1672-688X(2014)04-00245-03