益氣解毒化瘀方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-23和IL-10的影響

程 雪，査安生

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽省中醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230031)

·實(shí)驗(yàn)研究·

益氣解毒化瘀方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-23和IL-10的影響

程 雪1，査安生2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽省中醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230031)

目的觀察益氣解毒化瘀方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)大鼠血清白細(xì)胞介素-23(interleukin-23, IL-23)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平的影響，探討益氣解毒化瘀方治療UC的機(jī)制。方法將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶(salicylazosulfapyridine, SASP)組、益氣解毒化瘀方低劑量組和益氣解毒化瘀方高劑量組，每組10只大鼠。采用三硝基苯磺酸聯(lián)合無(wú)水乙醇灌腸法復(fù)制UC模型。藥物干預(yù)4周后，肉眼下觀察各組大鼠結(jié)腸大體病理?yè)p傷指數(shù)(chief morphology damage index, CMDI)，光鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織損傷指數(shù)(tissue damage index, TDI)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清IL-23和IL-10水平。結(jié)果各治療組大鼠結(jié)腸CMDI和TDI評(píng)分及血清IL-23水平較模型組顯著降低(P<0.01)，血清IL-10水平較模型組顯著升高(P<0.01)；益氣解毒化瘀方高劑量組在改善上述指標(biāo)方面顯著優(yōu)于益氣化瘀解毒方低劑量組和SASP組(P<0.05，或P<0.01)。結(jié)論益氣解毒化瘀方通過(guò)調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子平衡，達(dá)到治療UC目的。

潰瘍性結(jié)腸炎；白細(xì)胞介素-23；白細(xì)胞介素-10；組織形態(tài)學(xué)；益氣解毒化瘀方

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及黏膜和黏膜下層，以腹瀉、腹痛、黏液膿血便等為主要表現(xiàn)。該病治療難度大，療程長(zhǎng)，而且治愈后常易復(fù)發(fā)，已成為臨床常見(jiàn)的難治性疾病。UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為UC的發(fā)病主要涉及免疫調(diào)節(jié)紊亂、遺傳易感性、感染、環(huán)境及腸黏膜屏障受損等因素。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子之間平衡失調(diào)所致免疫異常是UC的重要發(fā)病機(jī)制。目前西醫(yī)對(duì)于UC尚無(wú)滿意的治療手段，而中醫(yī)藥具有毒性和不良反應(yīng)小、遠(yuǎn)期療效好等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)聯(lián)合無(wú)水乙醇復(fù)制UC大鼠模型，觀察中藥益氣解毒化瘀方對(duì)UC大鼠血清白細(xì)胞介素-23(interleukin-23,IL-23)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平的影響，探討其治療UC的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于安徽長(zhǎng)臨河生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(皖)2012-014。

1.2 藥物 益氣解毒化瘀方中所有藥物均由安徽省中醫(yī)院中藥房提供，藥物組成：薏苡仁30 g，馬齒莧、地錦草、炒谷芽各15 g，黨參、炒白術(shù)、赤芍、白芍、煨木香、白及、黃柏各10 g，三七粉5 g，黃連2 g。按組方比例稱取藥材，常規(guī)方法制備水煎液，每毫升含生藥1.5 g。西藥柳氮磺吡啶片(salicylazosulfapyridine, SASP)購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房，由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，每片0.25 g 。使用時(shí)將SASP去除包衣，研碎后過(guò)100目篩，用蒸餾水配成40 mg/ml混懸液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 5% TNBS：Sigma公司，批號(hào) P2297；無(wú)水乙醇：上海彤晟化工科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào) 100601；IL-23檢測(cè)試劑盒(批號(hào) SX201310348)、IL-17檢測(cè)試劑盒(批號(hào) SX201310256)、IL-10檢測(cè)試劑盒(批號(hào) SX201309251)：上海森雄生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 RT-6000型酶標(biāo)儀：雷杜公司；JW3021HR型離心機(jī)：安徽嘉文公司；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫箱：上海三發(fā)公司；BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)：安徽省電子科學(xué)研究所；RM2135型石蠟切片機(jī)：Leica公司；Nikon80型熒光顯微鏡：新飛達(dá)光學(xué)儀器。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將50只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、SASP組、益氣解毒化瘀方低劑量組(簡(jiǎn)稱中藥低劑量組)、益氣解毒化瘀方藥高劑量組(簡(jiǎn)稱中藥高劑量組)，每組10只。在22～28 ℃下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度50%～60%，自然光照周期，以普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2.2 模型復(fù)制 采用TNBS聯(lián)合無(wú)水乙醇灌腸法復(fù)制UC大鼠模型[1]。將大鼠正常飼養(yǎng)10 d后，于第11天禁食(不禁水)24 h，稱質(zhì)量，除正常組外，其他各組SD大鼠用10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉，予TNBS 100 mg/kg加50%無(wú)水乙醇0.25 ml，用直徑約1.5 mm聚丙烯管插入肛門上端約8 cm后，一次性注入上述混合試劑，捏緊肛門，提尾倒立3 min后，放回籠中自然蘇醒。模型復(fù)制后第2天，大鼠出現(xiàn)腹瀉、血便、懶動(dòng)等情況。隨機(jī)抽取2只模型大鼠處死，取腸組織，清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況，可見(jiàn)腸壁充血、水腫，內(nèi)壁紋理模糊；并取8 cm腸段用甲醛固定，病理切片可觀察到大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜損傷等病理改變，即可證實(shí)UC大鼠模型復(fù)制成功。

2.3 給藥 模型復(fù)制后將各組大鼠置于同等條件下喂養(yǎng)，模型復(fù)制后第13天，各組開(kāi)始給藥，每組大鼠的灌胃容積均為25 ml/kg。SASP組給予SASP 0.4 g/kg(相當(dāng)于成人劑量7倍)，每日給藥1次，共4周。給藥量根據(jù)體質(zhì)量而定，且所有實(shí)驗(yàn)大鼠每日稱體質(zhì)量1次，以便隨時(shí)調(diào)整給藥量。益氣化瘀解毒方高、低劑量組分別按30、15 g/kg灌胃(分別相當(dāng)于臨床成人臨床用量的14、7倍)，每日給藥1次，共4周。正常組及模型組大鼠均予等容積生理鹽水灌胃，每日1次，共4周。灌胃期間觀察大鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)、飲食狀況、糞便性質(zhì)、體質(zhì)量的改變。

2.4 血標(biāo)本采集 末次灌胃給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉后剖腹，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，取正中偏左切口，向右、向上至肋弓下向左剪開(kāi)，向左翻開(kāi)腹壁、腸及其附屬物，完全暴露腹主動(dòng)脈，負(fù)壓管采集血液，室溫靜置，待自然凝固收縮后，以3 500 r/min離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，用以測(cè)定IL-23和IL-10水平。

2.5 結(jié)腸標(biāo)本采集 取全段結(jié)腸，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，用冷生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，肉眼觀察結(jié)腸黏膜有無(wú)充血水腫、潰瘍和結(jié)腸管壁的變化。留取各組大鼠結(jié)腸病變最明顯處組織若干，10%甲醛浸泡，以備復(fù)制病理切片。

2.6 標(biāo)本檢測(cè)

2.6.1 血清IL-23和IL-10測(cè)定：按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定大鼠血清IL-23和IL-10的水平。

2.6.2 結(jié)腸大體病理?yè)p傷指數(shù)(chief morphology damage index，CMDI)觀察：取全段結(jié)腸，剪開(kāi)，用生理鹽水洗凈，平鋪于白板上，肉眼觀察腸黏膜病變，記錄潰瘍個(gè)數(shù)，測(cè)量潰瘍面積，并根據(jù)結(jié)腸黏膜的色澤、潰瘍、糜爛、出血點(diǎn)、充血等情況進(jìn)行CMDI評(píng)分[2]。最高分8分，包括黏連、潰瘍形成及炎癥。①黏連：無(wú)黏連，0分；輕度黏連(結(jié)腸與其他組織剝離較易)，1分；重度黏連，2分。②潰瘍形成及炎癥：無(wú)損傷，0分；局部充血，無(wú)潰瘍，1分；1處潰瘍不伴明顯炎癥(充血和腸壁增厚)，2分；1處潰瘍伴炎癥，3分；≥2處潰瘍伴炎癥，4分；多處損傷(包括潰瘍和炎癥)，長(zhǎng)度>1 cm，5分；多處損傷(包括潰瘍和炎癥)，長(zhǎng)度>2 cm，6分。

2.6.3 結(jié)腸組織損傷指數(shù)(tissue damage index, TDI)觀察：①病變深度：無(wú)，0分；黏膜層，1分；黏膜下層，2分；肌層，3分；漿膜層，4分。②炎癥程度：無(wú)，0分；輕度，1分；中度，2分；重度，3分。③病變范圍：無(wú)，0分；0～25%，1分；>25%且≤50%，2分；>50%且≤75%，3分；>75%，4分。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況觀察 正常組大鼠反應(yīng)靈敏，活動(dòng)及納食正常，毛發(fā)光潤(rùn)，糞便呈顆粒狀，體質(zhì)量較實(shí)驗(yàn)前明顯增加。模型組大鼠在模型復(fù)制后第2天即出現(xiàn)稀便或半稀便，部分大鼠出現(xiàn)肉眼血便，毛色失去光澤，活動(dòng)及進(jìn)食明顯減少，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量下降，嗜臥，扎堆，拱背。中藥高劑量組和SASP組大鼠在治療2周后精神逐漸恢復(fù)正常，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，食欲增強(qiáng)，活動(dòng)逐漸增多，大便逐漸成形。中藥低劑量組大鼠在用藥后精神也漸漸恢復(fù)，毛色漸有光澤，大便也逐漸成形，但恢復(fù)程度不及中藥高劑量組，進(jìn)程相對(duì)緩慢。

3.2 各組大鼠結(jié)腸CMDI和TDI比較 與正常組比較，模型組CMDI和TDI評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組CMDI和TDI評(píng)分均顯著降低(P<0.01)；中藥高劑量CMDI和TDI評(píng)分顯著低于中藥低劑量組和SASP組(P<0.05，或P<0.01)。見(jiàn)表1。各組大鼠結(jié)腸組織病理變化見(jiàn)圖1。

注：A．正常組；B．模型組；C．SASP組；D．益氣活血解毒方低劑量組；E．益氣活血解毒方高劑量組。

圖1各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

(蘇木精-伊紅染色，10×20倍)

表1 各組大鼠CMDI評(píng)分比較

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與SASP組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇P<0.01。

3.3 各組大鼠血清IL-23和IL-10水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-10水平顯著降低(P<0.01)，IL-23水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組IL-10水平顯著升高(P<0.01)，IL-23水平顯著下降(P<0.01)；中藥高劑量組IL-10水平顯著高于SASP組和中藥低劑量組(P<0.01)，IL-23水平顯著低于SASP組和中藥低劑量組(P<0.05，或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-23和IL-10水平比較

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與SASP組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇P<0.01。

4 結(jié)論

UC主要侵及腸道黏膜和黏膜下層，病變多數(shù)累及直腸和乙狀結(jié)腸，可伴有不同程度的全身癥狀和腸外表現(xiàn)[4]。本病可發(fā)生在任何年齡，多見(jiàn)于20～40歲，亦可見(jiàn)于兒童或老年，男女發(fā)病率無(wú)明顯差別。由于UC病情輕重不一，病程遷延不愈，治愈后常反復(fù)發(fā)作，預(yù)后較差，具有一定的癌變率，已成為臨床常見(jiàn)的難治性疾病。UC治療手段有限，西醫(yī)常采用氨基水楊酸類藥物(如SASP、奧沙拉嗪、巴柳氮)、糖皮質(zhì)激素類藥物、免疫抑制劑和生物制劑等治療UC，甚至采用外科手術(shù)切除病變，雖取得一定效果，但療效均不理想，且復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大。

UC病機(jī)復(fù)雜，其發(fā)病與多種因素相關(guān)。近年來(lái)許多研究證實(shí)，UC的發(fā)病可能是在遺傳、感染、環(huán)境等因素的影響下出現(xiàn)腸道免疫和非免疫系統(tǒng)功能失調(diào)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞和炎性遞質(zhì)異常，使腸道黏膜對(duì)抗原呈高敏狀態(tài)，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，最終導(dǎo)致腸黏膜慢性炎癥和組織損傷，而腸道免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有賴于免疫細(xì)胞及免疫球蛋白的參與。越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，免疫功能紊亂可能是UC發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。細(xì)胞因子作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)分子，與靶細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，在機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。其中促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和UC炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。

IL-23是IL-12分子家族中促炎性細(xì)胞因子，主要是由激活的單核-巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，由IL-12 p40和IL-23 p19亞單位組成。IL-23具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能，參與集體控制感染和自身免疫性疾病發(fā)生。IL-23還可以誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為具有致病性Th17細(xì)胞，并生成IL-17、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)，引起結(jié)腸炎癥的發(fā)生。

IL-10又名細(xì)胞因子合成抑制因子，是典型的抗炎與免疫抑制性細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其主要的生物學(xué)作用是抑制活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞平衡上起重要作用。

UC屬于中醫(yī)學(xué)“痢疾”“久痢”“腸風(fēng)”“臟毒”“腸癖”“腹?jié)M”“下利”等疾病范疇。病位在脾胃、大腸，濕熱與瘀血為本病的根本病機(jī)。UC治療上多以補(bǔ)益脾胃、清熱化濕、活血化瘀為原則。益氣解毒化瘀方中，以黨參、白術(shù)為君，補(bǔ)脾益氣、燥濕利水；赤芍、白芍伍用，白芍?jǐn)筷?，赤芍涼血，退血分之熱；馬齒莧、地錦草合用，清熱解毒、涼血止?。蝗?、白及功?；钛叙觥刊徤?；薏苡仁、炒谷芽健脾消積利水；黃連配黃柏燥濕清熱、涼血解毒而止大便膿血；木香配黃連，行腸胃滯氣而除里急后重。前期研究已證實(shí)，采用清熱解毒、活血化瘀療法聯(lián)合SASP治療UC，可明顯縮短腹瀉、黏液膿血便及腹痛的時(shí)間，明顯降低證候積分，顯著提高綜合療效、結(jié)腸黏膜病變的療效[6]。

本研究結(jié)果表明，益氣解毒化瘀方可能是通過(guò)下調(diào)促炎性細(xì)胞因子IL-23，上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子IL-10，從而調(diào)控失衡的細(xì)胞因子，減少炎性遞質(zhì)的釋放，來(lái)有效減輕炎性損傷，以促進(jìn)腸黏膜修復(fù)與潰瘍愈合，達(dá)到治療UC的目的。這些可能是益氣解毒化瘀方藥治療UC的作用機(jī)制之一。

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EffectsofQi-tonifying,Detoxicating,andStasis-resolvingPrescriptiononSerumInterleukin-23andInterleukin-10LevelsinRatswithUlcerativeColitis

CHENGXue1,ZHAAn-sheng2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.DepartmentofGastroenterology,AnhuiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

ObjectiveTo observe the effects of qi-tonifying, detoxicating, and stasis-resolving prescription (QDSP) on serum interleukin-23 (IL-23) and interleukin-10 (IL-10) levels in rats with ulcerative colitis (UC) and to investigate the action mechanism of QDSP in the treatment of UC.MethodsFifty male Sprague-Dawley rats were randomly and equally divided into normal group, model group, salicylazosulfapyridine (SASP) group, and low- and high-dose QDSP groups. All rats except those in normal group were treated with an enema containing trinitrobenzenesulfonic acid and anhydrous ethanol to induce a UC model. The SASP group and QDSP groups

respective treatments for 4 weeks. The colon macroscopic damage index (CMDI) was determined by visual inspection, and the tissue damage index (TDI) was determined under a light microscope. Serum IL-23 and IL-10 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsAll treatment groups showed significant decreases in CMDI and TDI scores and serum IL-23 level (P<0.01) and a significant increase in serum IL-10 level (P<0.01), as compared with the model group. The high-dose QDSP group showed significantly more improvements in the above indices than the low-dose QDSP group and SASP group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionQDSP can balance the proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines in the treatment of UC.

ulcerative colitis; interleukin-23; interleukin-10; histomorphology; qi-tonifying, detoxicating, and stasis-resolving prescription

程雪(1988-)，女，碩士研究生

查安生，zhaansheng2006@163.com

R574；R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.04.023

2014-01-29)