趨化因子CXCL9在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義

洪亮 程志儉 殷慶章 徐宏智 湯承輝 龔梨峰

(復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院普外科，上海 200240)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率居世界惡性腫瘤的第2位，占惡性腫瘤總發(fā)病人數(shù)的9.74%，且其發(fā)病率呈上升趨勢，尤其在發(fā)展中國家[1]。侵襲和遠處轉(zhuǎn)移是CRC患者預后不良的主要原因[2]。趨化因子是一類小分子蛋白多肽，屬于具有化學趨化作用的細胞因子超家族。現(xiàn)已有超過50種的趨化因子被確認，其中，CXCL9、CXCL12、CXCL16、CXCL10等與腫瘤關(guān)系密切[3-4]。目前，關(guān)于CXCL9在CRC中的表達及其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預后的關(guān)系鮮有報道。本實驗探討CXCL9在結(jié)直腸癌中的表達及其與CRC臨床病理因素間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年7月—2012年12月在復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院行根治性手術(shù)治療的60例CRC患者(CRC組)，均經(jīng)術(shù)前活體組織檢查確診，臨床資料完整，且未接受任何治療。60例CRC患者中，男性39例，女性21例；年齡45～80歲，平均年齡(58.5±7.3)歲；結(jié)腸癌44例，直腸癌16例；腫瘤直徑<5 cm 32例，≥5 cm 28例；Dukes A期19例，B期12例，C期14例，D期15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；右半結(jié)腸切除術(shù)19例，左半結(jié)腸切除術(shù)14例，乙狀結(jié)腸切除術(shù)7例，橫結(jié)腸切除術(shù)4例，直腸癌根治術(shù)16例。另選20例健康志愿者作為對照組，其中男性13例，女性7例；年齡38～62歲，平均年齡(45.3±6.8)歲。

1.2 標本采集 組織采集：術(shù)中取新鮮CRC組織、癌旁組織、正常結(jié)直腸組織和區(qū)域淋巴結(jié)(每例2份)，分別于4%甲醛溶液中固定，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存；癌旁組織取自距癌組織≤1 cm的組織；正常結(jié)直腸組織取自距癌組織≥5 cm的組織；區(qū)域淋巴結(jié)取自腸周系膜組織，HE染色后確定轉(zhuǎn)移情況。血清采集：CRC患者入院后未接受任何治療，于入院后第1天清晨6時空腹抽取靜脈血5 mL，肝素抗凝，于4 ℃冰箱靜置1 h，然后以3000 r/min離心15 min，抽取上清液，-20 ℃凍存待檢。健康志愿者的血清收集方法如前所述。

1.3 主要試劑 ELISA試劑盒購自美國R&D公司，抗人CXCL9單克隆抗體、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)、S-P免疫組織化學試劑盒均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，SYBR Green預混液購自美國ABI公司。

1.4 方法

1.4.1 CXCL9的表達及結(jié)果判定 將CRC組織、癌旁組織、正常結(jié)直腸組織和區(qū)域淋巴結(jié)進行石蠟包埋，以4 μm的厚度切片、烤片、脫蠟返水、抗原修復。采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，SP)進行免疫組化染色，CXCL9抗體工作濃度為1∶150，二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)染色，常規(guī)蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對照。免疫組織化學染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片。在光鏡下，隨機選擇10個高倍視野(×400)，計數(shù)1000個細胞，采用許良中等[5]的計分方法，即無著色記為0分，著色弱記為1分，著色適中記為2分，著色深記為3分；無著色記為0分，陽性細胞百分比≤10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分。2項計分乘積>3分為陽性，否則為陰性。

1.4.2 CXCL9 mRNA的表達 取CRC組織、癌旁組織、正常結(jié)直腸組織和區(qū)域淋巴結(jié)，用Trizol抽取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA，然后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法檢測CXCL9 mRNA，引物序列參照Huang等[6]設(shè)計。CXCL9上游引物：5′-GGCATCATCTTGCTGGTTCT-3′；下游引物：5′-TCACTCTGCTGAATCTGG-3′。內(nèi)參3-磷酸甘油脫氫酶(3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′；下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。目的基因CXCL9 mRNA的相對表達量以CXCL9和GAPDH的比值計算。

1.4.3 血清CXCL9的濃度 實驗前將試劑、樣本于室溫中放置2 h，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清CXCL9的濃度。按試劑盒說明稀釋標準品，加樣，37 ℃孵育30 min；洗板5次，每孔依次加入50 μL酶標抗體，37 ℃孵育30 min；洗板5次，每孔依次加入顯色劑A、B各50 μL，避光顯色10 min；加入終止液，15 min內(nèi)在酶標儀(波長450 nm)上讀取OD值。根據(jù)標準品的濃度及相應(yīng)OD值計算出標準曲線，并以此計算出各樣本CXCL9的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 CXCL9在各組織中的表達 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，CXCL9主要表達于細胞膜、細胞質(zhì)中，呈淡黃色或棕黃色，間質(zhì)不著色，見圖1。正常結(jié)直腸組織、癌旁組織、無癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)中的CXCL9蛋白表達陽性率均顯著低于CRC組織；有癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)中CXCL9蛋白表達陽性率顯著高于無癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。Real-Time PCR結(jié)果顯示，各組織中均可見CXCL9 mRNA的表達；正常結(jié)直腸組織、癌旁組織、CRC組織中CXCL9 mRNA的表達依次增強，CRC組織中CXCL9 mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織、正常結(jié)直腸組織及無癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)(P<0.01)。

表1 各組織中CXCL9蛋白表達陽性率的比較(n，%)

A：CRC組織；B：癌旁組織；C：區(qū)域淋巴結(jié)；D：正常結(jié)直腸組織

2.2 CXCL9的表達與CRC臨床病理因素的相關(guān)性分析 隨著浸潤深度、Dukes分期的增加，CXCL9的陽性表達率明顯增加(P<0.05)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者CXCL9 陽性表達率顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑的CRC患者CXCL9的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 CRC組織中CXCL9的表達與臨床病理因素的關(guān)系(n，%)

2.3 CRC組與對照組血清CXCL9濃度的比較 CRC組血清CXCL9平均濃度為(28.43±6.41)ng/L，高于對照組(7.65±1.32)ng/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著CRC Dukes分期的增加，血清CXCL9的平均濃度增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC患者血清CXCL9的平均濃度[(31.84±5.73)ng/L]高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者[(20.87 ±3.62)ng/L]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2～3。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

與對照組比較，**P<0.01，與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，△P<0.05,△△P<0.01

3 討 論

CRC的發(fā)病因素復雜，通常與感染、免疫、遺傳等因素有關(guān)。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是CRC患者的主要死因，CRC患者中有50%～60%發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率不足10%[7]。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移機制目前尚不清楚。研究[8]表明，腫瘤微環(huán)境在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用。有研究[9-11]表明，CCL2、CCL3、CCL4、CCL5等炎性趨化因子和CXCL1、CXCL5、CXCL8等血管生成性趨化因子的表達水平在CRC組織中較正常組織明顯升高，提示這些趨化因子及其受體在CRC的進展、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。然而，抗血管生長因子CXCL9在CRC中的作用近年來才逐漸受到關(guān)注。

CXCL9又稱Mig，即γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)誘導的趨化因子，由巨噬細胞及單核細胞分泌，主要趨化活化的T細胞，并在急性移植物抗宿主病中起重要作用。在惡性黑色素瘤中，CXCL9通過趨化T淋巴細胞至腫瘤部位而抑制腫瘤生長。同時，CXCL9與其配體CXCR3結(jié)合后可抑制腫瘤血管生成。 近年來的研究[3-4,12]顯示，在胃癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔鱗狀細胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤等患者的腫瘤組織及血清中均可檢測到CXCL9的高表達。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中CXCL9蛋白及mRNA的均呈高表達，顯著高于正常結(jié)直腸組織和癌旁組織(P<0.01)，有癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)中CXCL9表達顯著高于無癌轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)(P<0.01)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著浸潤深度、Dukes分期的增加，CXCL9的陽性表達率明顯增加，且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC患者CXCL9蛋白的表達顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑的CRC患者間CXCL9的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CRC患者的血清CXCL9平均濃度高于健康志愿者(P<0.05)；在Dukes分期不同的CRC患者中，CXCL9的平均濃度有升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC患者血清CXCL9濃度顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，CXCL9在CRC組織中呈過表達狀態(tài)，且血清CXCL9含量可能與腫瘤負荷及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，趨化因子CXCL9可能參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過程，其表達水平與CRC的浸潤深度、臨床分期、轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。隨著研究的不斷深入，趨化因子CXCL9可能會成為CRC復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移及預后的預測指標，并有望為進一步研究CRC的發(fā)病機制以及生物治療靶點提供新的策略。

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