德夯嗜鹽耐鹽菌抗菌活性篩選和系統(tǒng)發(fā)育*

李洪軍,肖建青,2,程金蓮,劉 荷,鐘小娟,易 旻,賀建武,劉祝祥,陳義光

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

德夯嗜鹽耐鹽菌抗菌活性篩選和系統(tǒng)發(fā)育*

李洪軍1,肖建青1,2,程金蓮1,劉 荷1,鐘小娟1,易 旻1,賀建武1,劉祝祥1,陳義光1

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

以8個(gè)敏感菌株作為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法，對(duì)分離自湖南省德夯峽谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)普通非鹽環(huán)境土壤樣品中的294株嗜鹽及耐鹽細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性篩選，并對(duì)其中具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株進(jìn)行基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析.受試菌株中有109株的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性(陽(yáng)性率37.1%)，其中5個(gè)菌株具有較強(qiáng)抗菌活性(JSM 102030，JSM 102052，JSM 102054，JSM 102066，JSM 102082).基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這5個(gè)菌株分別屬于細(xì)菌域(Eubacteria)的3個(gè)門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個(gè)科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4個(gè)屬，菌株JSM 102030屬于Halobacillus屬，與該屬已知種Halobacillus trueperi DSM 10404T的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性為99.1%)，JSM 102052和JSM 102054屬于Halomonas屬，與Halomonas alkaliphila 18bAGT的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性為98.3%)，JSM 102066屬于Nocardiopsis屬，與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性為99.3%)，JSM 102082與Oceanobacillus屬的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因序列相似性聚在一起.研究結(jié)果表明，分離自湖南省德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣的嗜鹽及耐鹽細(xì)菌中存在較高比例的抗菌活性菌株，且這些細(xì)菌具有較為豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性.

普通非鹽環(huán)境；嗜鹽菌；耐鹽菌；抗菌活性篩選；系統(tǒng)發(fā)育分析

極端微生物(Extremophile)是指那些在一般生物不能生存的條件下(如極酸極堿、極熱極冷、高鹽、高壓等)能夠生存的微生物[1].地球上存在著大量自然形成或者人工形成的鹽域環(huán)境，如自然形成的死海等水環(huán)境和鹽土環(huán)境，以及人工形成的如鹽場(chǎng)、鹽池、鹽腌制食品等.自然界高鹽環(huán)境的不同，其離子組成和鹽濃度具有較大差異，這是由于形成過(guò)程和所處地質(zhì)情況造成的.生活在這些高鹽環(huán)境中的動(dòng)植物種類較為有限，而以處于不同類群的微生物，如綠藻、嗜鹽古菌和嗜鹽及耐鹽的細(xì)菌等為其主要生命形式[2].而嗜鹽菌(Halophile)就是在海洋、鹽湖、鹽場(chǎng)以及腌制食品等高鹽環(huán)境中生存的一種微生物[3].嗜鹽及耐鹽菌具有特殊的生理機(jī)制、奇特的環(huán)境適應(yīng)模式以及獨(dú)特的基因類型，使其不僅在存在的環(huán)境中對(duì)物質(zhì)的自然轉(zhuǎn)化發(fā)揮著重要作用，而且在高鹽堿性污水處理過(guò)程中也表現(xiàn)出較大的應(yīng)用前景，其分泌的相關(guān)酶類在工業(yè)中也有較為廣泛的應(yīng)用[2].嗜鹽及耐鹽菌的生物活性多樣性及其物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，吸引人們利用該類微生物開發(fā)新型抗生素和新藥前體物質(zhì)[4].中國(guó)擁有廣闊的鹽環(huán)境和豐富的嗜鹽耐鹽微生物資源，近年來(lái)中國(guó)學(xué)者對(duì)這些微生物資源進(jìn)行了研究，并篩選出一批具有較強(qiáng)生物活性的菌株[5-7].然而，Echigo A等[8]在日本東京周邊地區(qū)的果園、草坪等普通非鹽環(huán)境土壤中分離出176株能耐受20%(質(zhì)量體積比)NaCl的芽胞桿菌科(Bacillaceae)嗜鹽或耐鹽細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其中有15株代表潛在新類群(potential novel taxa).目前，國(guó)內(nèi)對(duì)普通非鹽環(huán)境土壤中的嗜鹽及耐鹽微生物的分離和抗菌活性篩選的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.

湖南省吉首市德夯峽谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)地處湘西土家族苗族自治州首府吉首市境內(nèi)，與鳳凰、花垣、保靖3縣交界，位于武陵山南支脈的南端，為云貴高原—江南丘陵的過(guò)渡地帶.總面積252 km2，是湖南省著名的風(fēng)景旅游區(qū)和國(guó)家地質(zhì)公園[9-10].地質(zhì)構(gòu)造屬中國(guó)東部新華夏系構(gòu)造亞帶的一部分，地貌屬湘西北強(qiáng)烈上升侵溶蝕的中低山區(qū)南端，境內(nèi)多陡坡峭壁，多條溪流穿梭于其間，呈半封閉式的“V”形峽谷，深達(dá)數(shù)百米，山原破碎，地形復(fù)雜，為典型的喀斯特巖溶峽谷景觀.該地年均氣溫16～17 ℃，無(wú)霜期215～286 d，全年日照1 400 h左右，年降雨量1 200 ～1 600 mm，土壤多為石灰?guī)r發(fā)育而成的山地黃壤，屬于普通非鹽環(huán)境土壤.因其獨(dú)特的地理位置、地貌和復(fù)雜多樣自然環(huán)境條件，境內(nèi)孕育并保存了豐富的生物多樣性[11].

筆者近年對(duì)該地區(qū)普通非鹽環(huán)境土樣中的嗜鹽及耐鹽微生物資源進(jìn)行一系列的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)其中可培養(yǎng)嗜鹽及耐鹽菌存在較為豐富的多樣性.文中報(bào)道了對(duì)分離自德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中的嗜鹽及耐鹽細(xì)菌(含放線菌)的抗菌活性篩選結(jié)果，并對(duì)部分陽(yáng)性菌株進(jìn)行了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為該類微生物資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要儀器和試劑 離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司(5810R)，顯微鏡購(gòu)自Leica公司(DM 3000)，PCR儀購(gòu)自BIO-RAD公司(PE-9600)；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；其他試劑和儀器同文獻(xiàn)[6].

1.1.2 主要培養(yǎng)基 (1)斜面培養(yǎng)基(Marine Agar 2216,MA)：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，NaCl 19.45 g，MgCl25.9 g，Na2SO43.2 g，CaCl21.9 g，復(fù)合鹽A液20 mL，復(fù)合鹽B液1 mL，瓊脂20.0 g，水1 L，pH值7.5～7.8.其中復(fù)合鹽A液為檸檬酸鐵5 g，KCl 27.5 g，Na2CO38 g，水1 L；復(fù)合鹽B液為SrCl 34 g，KBr 80 g，H3BO322 g，Na2SiO34 g，(NH4)2SO41.6 g，Na2HPO48 g,水1 L.(2)液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，甘露醇5 g,CaCO31 g，NaCl 20 g，其他成分同斜面培養(yǎng)基，pH值7.5～7.8.(3)液體(搖瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，大豆粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 20.0 g，CaCO31.0 g，復(fù)合鹽A液20 mL，復(fù)合鹽B液1 mL，水1 L,pH值7.5～7.8.(4)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar,NA):蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0 g,水1 L,pH值7.2～7.5.

1.1.3 菌株來(lái)源 實(shí)驗(yàn)菌株共294株，是本室用添加5%～20% NaCl的Marine Agar 2216 (MA)等高鹽培養(yǎng)基分離自德夯峽谷的森林、耕作區(qū)及溪流等非鹽環(huán)境土壤.抗菌活性篩選用的8株敏感指示菌分別是革蘭陽(yáng)性菌(枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisATCC 6051)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25922)、藤黃八疊球菌(SarcinaluteaGCMCC 1.880))、革蘭陰性菌(大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 128)、產(chǎn)氣桿菌(EnterobacteraerogenesATCC 8724)、變形桿菌(ProteusvulgarisATCC 8427))、真菌(白色念珠菌(CandidaalbicansNCPC 1027)和黑曲霉(AsperillusnigerNCPC 1003)).

1.2方法

1.2.1 抗菌活性初篩 用5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基洗下一支新鮮斜面菌體，接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)96 h.發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取上清液用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂擴(kuò)散法[12]測(cè)定其抗菌活性.重復(fù)3次，指示菌平板28 ℃培養(yǎng)48 h，記錄抑菌結(jié)果.

1.2.2 抗菌活性復(fù)篩 用5 mL液體種子培養(yǎng)基洗下一支初篩抗菌活性陽(yáng)性菌株新鮮斜面菌體，將菌體接種到裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h.取種子液10 mL(按10%接種量)接入裝有90 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h.再按1.2.1所述方法進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn).

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 按文獻(xiàn)[13]中使用的方法對(duì)具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株進(jìn)行基因組DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增，寄給生工生物工程(上海)有限公司完成測(cè)序.擴(kuò)增和測(cè)序使用1對(duì)細(xì)菌通用引物：正向引物8-27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1523-1504r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).所得序列提交國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank保存并獲得序列號(hào)，用EzTaxon-e[14]提供的數(shù)據(jù)庫(kù)和在線軟件進(jìn)行序列相似性計(jì)算，并調(diào)出相似性較高的菌株的16S rRNA基因序列；使用CLUSTAL_X軟件進(jìn)行基因序列多重比對(duì)[15]，運(yùn)用MEGA 4.0軟件[16]采用鄰接法(Neighbor-Joining方法)[17]進(jìn)行聚類分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析，以評(píng)估進(jìn)化樹的穩(wěn)定性[18].

1.2.4 表型特征 分別采用不同質(zhì)量體積比(0%，1%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)NaCl的相應(yīng)培養(yǎng)基平板測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)鹽的耐受性.菌落特征、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1抗菌活性篩選

2.1.1 初篩 對(duì)294株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行抗菌活性初篩.統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液至少對(duì)1株指示菌有抗菌活性的菌株共有109株，陽(yáng)性率37.1%，其中對(duì)黑曲霉(48株)和金黃色葡萄球菌(29株)具有較高抗菌活性(見(jiàn)表1).

表1 分離自德夯峽谷非鹽土樣的菌株抗菌活性篩選結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1.2 復(fù)篩 對(duì)初篩得到的109株抗菌活性陽(yáng)性菌株進(jìn)行復(fù)篩.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5株菌 (JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣(見(jiàn)表2).

表2 德夯峽谷非鹽土樣分離菌株抗菌活性復(fù)篩結(jié)果 /mm

注 “-”表示陰性.

2.2抗菌活性陽(yáng)性菌株表型特征

對(duì)5株抗菌效果較好的菌株進(jìn)行菌落特征、細(xì)胞顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征等觀察(見(jiàn)表3).結(jié)果表明：5個(gè)株菌中3株為革蘭氏陽(yáng)性菌，2株為革蘭氏陰性菌；這些菌株的NaCl耐受范圍較廣(在0%～15%內(nèi))，最適生長(zhǎng)鹽度范圍為3%～7%(質(zhì)量體積比)NaCl(見(jiàn)表3)，5株菌均為中度嗜鹽菌[2].

表3 抗菌活性較強(qiáng)的5個(gè)株菌部分表型特征

注 “+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性；“W”表示弱陽(yáng)性；酪素和吐溫-80水解均為陰性.

2.3基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)5個(gè)抗菌活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定、相似性搜索、序列多重比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建等系統(tǒng)發(fā)育分析.結(jié)果表明，這5個(gè)菌株類群多樣性較高，分屬于3個(gè)門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個(gè)科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4個(gè)屬.菌株JSM 102030屬于Halobacillus屬(Firmicutes門Bacillaceae科)，與該屬已知種Halobacillus trueperi的典型菌株(Type strain)DSM 10404T的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性為99.1%)；JSM 102052和JSM 102054同屬于Halomonas屬(Proteobacteria門Halomonadaceae科)，與Halomonas alkaliphila 18bAGT的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切(序列相似性為98.3%)；JSM 102066屬于Nocardiopsis屬(Actinobacteria門Nocardiopsaceae科)，與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性為99.3%)；JSM 102082與Firmicutes門Bacillaceae科Oceanobacillus屬的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因聚在一起(見(jiàn)圖1).

圖1 基于16S rRNA基因序列的5株具有較強(qiáng)抗菌活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)從普通環(huán)境中分離篩選新的活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的難度日益上升[7].目前，微生物及其活性物質(zhì)的篩選急需擴(kuò)大范圍，即不僅要繼續(xù)發(fā)掘特殊生境下土壤的微生物資源(例如沙漠及高原地帶、高鹽堿環(huán)境、溫泉等)，還要分離和篩選植物內(nèi)生菌，開發(fā)和應(yīng)用海洋及極地微生物等資源，這是微生物研究的必然趨勢(shì)[20-23].

文中研究結(jié)果表明，從湖南省吉首市德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中分離的294株菌中，有109株菌的發(fā)酵液具有對(duì)1種以上敏感指示菌有抗菌活性，其中5株菌株(JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)的發(fā)酵產(chǎn)物具較強(qiáng)的抗菌活性，其抗菌譜較廣.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，5株抗菌活性較強(qiáng)的菌株類群多樣性較高，屬于3個(gè)門(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3個(gè)科(Nocardiopsaceae,Bacillaceae,Halomonadaceae)的4個(gè)屬(Nocardiopsis,Halobacillus,Oceanobacillus,Halomonas).本研究的結(jié)果說(shuō)明，從德夯峽谷普通非鹽環(huán)境土樣中分離得到的的嗜鹽和耐鹽細(xì)菌具有較高比例能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的菌株，有一定的開發(fā)潛力.筆者前期研究[24-25]和本研究的結(jié)果都說(shuō)明，從普通非鹽環(huán)境土樣中的耐鹽和嗜鹽微生物中篩選抗菌活性菌株是發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌的途徑之一.

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(責(zé)任編輯 陳炳權(quán))

ScreeningandPhylogeneticAnalysisofAntibiotic-ProducingHalophilicandHalotolerantBacteriafromtheDehangCanyoninHunanChina

LI Hongjun1,XIAO Jianqing1,2,CHENG Jinlian1,LIU He1,ZHONG Xiaojuan1,YI Min1,HE Jianwu1,LIU Zhuxiang1,CHEN Yiguang1

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China;2.Jiugui Liquor Co.Ltd.,Jishou 416000,Huana China)

The antimicrobial activity of the fermentation brothes of 294 halophilic and halotolerant bacteria,isolated from ordinary non-saline soils collected from the Dehang Canyon (28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E) in Hunan Province,China,was screened using the agar diffusion method employing 8 indicator microorganisms (three Gram-positive bacteria,three Gram-negative bacteria and two fungi).The results showed that,out of 294 strains tested,109 were positive in antimicrobial activity (37.1%),in which 5 strains exhibited strong antimicrobial activity.Then these 5 strains were submitted for 16S rRNA gene amplification and phylogenetic analysis after phenotypic characterization including morphological,biochemical and physiological tests.The results suggested that these 5 strains were members of 4 genera in 3 families (Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae) of 3 phyla (Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria):strain JSM 102030 belonged to the genusHalobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),being most closely to the type strain of Halobacillus trueperi (sequence similarity 99.1%);strains 102052 and JSM 102054 were members of the genusHalomonas(Proteobacteria,Halomonadaceae),being related most closely to the type strain of Halomonas alkaliphila (98.3%);strains JSM 102066 strain JSM 2155017 belonged to the genusNocardiopsis(Actinobacteria,Nocardiopsaceae),exhibiting 99.3 % 16S rRNA gene sequence similarity to Nocardiopsis prasina DSM43845T;strain JSM 102082 belonged to the genusOceanobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),exhibiting 99.6% 16S rRNA gene sequence similarity to Oceanobacillus kimchii X50T.

ordinary non-saline environment;halophilic bacteria;halotolerant bacteria;antimicrobial activity;phylogenetic analysis

1007-2985(2014)06-0073-05

2014-07-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31460004，30970007)；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(JSU071312Z01)；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(201208Z01)

李洪軍(1978—)，男，湖南漣源人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士生，主要從事微生物資源與生態(tài)研究

陳義光(1965—)，男，湖南新化人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源與生態(tài)研究.

Q9393.92

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.06.018