鹽脅迫下吡蟲啉對棉田土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響

張清明，馮瑞芝，2，張保華，劉鑫剛，王 智

（1.青島農(nóng)業(yè)大學 化學與藥學院，山東 青島266109；2.西北農(nóng)林科技大學 理學院，陜西 楊凌712100）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物之一，由于其具有耐鹽特性，從而適宜在相對鹽堿土地上種植。黃河三角洲地區(qū)土壤在不同程度上有一定的鹽堿特征，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中更適合于一些耐鹽植物的種植。因此，目前棉花已成為黃河三角洲地區(qū)的主要農(nóng)作物之一［1］。由于該地區(qū)土壤特征有其特殊性，農(nóng)藥等外源污染物的引入勢必會對該地區(qū)土壤生態(tài)產(chǎn)生一定程度的影響。土壤微生物是維持土壤生態(tài)功能的重要組成部分，與土壤肥力和土壤健康有著密切聯(lián)系，其數(shù)量多少與酶活性的高低在很大程度上能反映出土壤物質循環(huán)和轉化的強度，因此土壤微生物數(shù)量和土壤酶經(jīng)常被用來作為評價土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的重要指標。土壤微生物活性與土壤類型［2］、土地利用方式［3］、施肥［4］、農(nóng)藥［5］等外源污染物影響關系密切。農(nóng)藥作為農(nóng)田環(huán)境中主要的外源污染物之一，其對土壤生態(tài)環(huán)境的影響已引起越來越多的環(huán)境和土壤學領域相關學者的關注。吡蟲啉作為煙堿類超高效殺蟲劑，主要用于防治蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式害蟲，在棉花、小麥、水稻等作物中廣泛應用。因此吡蟲啉對土壤環(huán)境的影響也有一些相關報道，例如劉慧君等［6］研究表明土壤呼吸強度對吡蟲啉較為敏感，使用初期會對土壤呼吸有強烈的抑制作用，但隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制作用逐漸消失。鄭巍等［7］發(fā)現(xiàn)低濃度吡蟲啉對土壤過氧化氫酶有抑制作用，而高濃度有激活作用。Singh等［8］研究了吡蟲啉對花生田土壤中脫氫酶和堿性磷酸酶的影響，結果表明吡蟲啉處理種子播種15～60d內(nèi)能顯著提高土壤中這兩種酶的活性。而吡蟲啉對于黃河三角洲地區(qū)相對鹽堿類型土壤的影響尚未見報道，因此本文以黃河三角洲棉田土壤為研究對象，排除天氣、植物根系及其他因素，利用室內(nèi)培養(yǎng)試驗測定鹽脅迫下不同濃度吡蟲啉對土壤微生物數(shù)量和幾種酶活性的影響，探明其中的規(guī)律，以期為吡蟲啉對鹽堿土壤環(huán)境的安全評價及合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡蟲啉標準品（98.5%），由德國 Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)；其他化學試劑均為分析純。SHP－250型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JA5003N電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 土壤樣品

供試土壤采集于黃河三角洲地區(qū)山東省濱州市濱城區(qū)梁才街道灘部村棉田。取樣方法采用五點法，采集過程中除去土壤表面的雜草、枯葉和1cm左右的表層土后，采集耕作層約為20cm厚度的土壤。采集回來的土壤樣品先剔除石塊和植物體等雜物，再經(jīng)自然風化，過1mm篩。完全混合后放置4℃?zhèn)溆?。土壤為沙壤土，pH 值為7.65，有機質14.2g／kg，有機氮97.6mg／kg，速效磷13.6mg／kg，速效鉀112.7 mg／kg，含鹽量0.09%。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤的預處理與試驗設計 向過篩后的土壤樣品中加入蒸餾水，使其含水量達到最大持水量的60%。完全混勻后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14d，恢復其生物學特性。文獻檢索表明吡蟲啉在土壤中的初始殘留量一般在10μg／g以下，因此本試驗中吡蟲啉共設 4 個施藥劑量 （0，0.4，2.0，10 μg／g），添加鹽的濃度設置為0，0.3%兩個處理。每個處理均設置三次重復，其處理如表1所示。

表1 供試土壤的處理

1.3.2 土壤染毒 稱取約1 000g預培養(yǎng)的土壤，分出約100g土壤，按表1所示的處理濃度分別加入不同濃度的以乙腈為溶劑的吡蟲啉工作溶液和氯化鈉固體，混合均勻后，再將這100g土壤混入剩余的土壤中，使土壤混合均勻，調(diào)節(jié)其含水量為最大持水量的60%，分裝250ml棕色試劑瓶中（每瓶裝約100 g土壤），放于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每隔2d調(diào)節(jié)一次水含量，使之保持恒定。藥劑處理后分別于7，14，21，28d測定土壤微生物的數(shù)量和土壤酶的活性。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量的測定 微生物數(shù)量測定采用平板計數(shù)法［9］。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌采用改良高氏一號培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，選取每皿30～300個菌落的平板進行計數(shù)，計數(shù)結果以每克干土中的菌落平均數(shù)表示。

1.3.4 土壤酶活性的測定 土壤堿性磷酸酶的活性采用磷酸苯二鈉比色法，酶活性單位用PNP（對硝基苯）μg／g干土表示；土壤脲酶活性測定采用靛酚藍比色法測定，酶活性單位以NH4－Nμg／g干土表示；土壤中的β－葡萄糖苷酶活性采用對硝基酚－β－D－吡喃葡糖苷比色法測定，具體操作方法參照文獻［10－12］。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

利用Excel 2007和SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)結果表示為平均值±標準差，同一時間不同處理之間的差異采用Duncan′s新復極差法進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下吡蟲啉對棉田土壤微生物數(shù)量的影響

2.1.1 吡蟲啉對土壤細菌數(shù)量的影響 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤細菌數(shù)量的影響如表2所示，土壤中細菌的數(shù)量與吡蟲啉的處理濃度、處理時間有關。低鹽土壤中，和對照相比，施0.4，2，10μg／g吡蟲啉7d后，細菌數(shù)量顯著增加，這可能與培養(yǎng)初期吡蟲啉為細菌提供了刺激其生長的碳源和能源有關。而14d后中濃度（2μg／g）和高濃度（10μg／g）吡蟲啉處理的土壤中細菌數(shù)量明顯減少，在21d時達到最小，細菌數(shù)量分別比對照減少了32.3%和35.6%，出現(xiàn)這種情況可能是吡蟲啉降解產(chǎn)物抑制了土壤中細菌的生長。在添加0.3%鹽時，整個實驗周期內(nèi)吡蟲啉對土壤中細菌數(shù)量表現(xiàn)出一定的刺激作用，特別是在7d時，0.4，2.0，10μg／g吡蟲啉處理的土壤中細菌數(shù)量和對照相比分別增加了13.8%，44.3%，79.9%。隨著培養(yǎng)時間的延長，在28d時除10μg／g吡蟲啉處理組外，其他濃度吡蟲啉處理組中細菌數(shù)量均恢復到對照水平。這可能是鹽能鈍化吡蟲啉的降解從而降低了吡蟲啉降解產(chǎn)物對土壤細菌生長的抑制作用，此推測還需進一步研究。從兩種鹽處理土壤細菌數(shù)量上進行比較，在添加0.3%鹽的土壤中細菌數(shù)量明顯少于不加鹽的土壤，這說明鹽的存在對細菌有毒性作用，本文發(fā)現(xiàn)也證實了周玲玲等［13］的觀點。

2.1.2 吡蟲啉對土壤放線菌數(shù)量的影響 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤放線菌數(shù)量的影響見表3。由表3可知，在28d的實驗周期內(nèi)，不同濃度吡蟲啉處理土壤中放線菌數(shù)量顯著低于對照水平，且吡蟲啉濃度越大，放線菌數(shù)量越少，這說明吡蟲啉及其降解產(chǎn)物對放線菌有一定的毒性作用，從而產(chǎn)生了抑制作用。而在添加0.3%鹽的土壤中，與對照相比，三個濃度的吡蟲啉在7，14，21d對放線菌有顯著的刺激作用（p＜0.05），且吡蟲啉的濃度越大刺激作用越強，特別是在14d時，這種刺激作用達到最大，和對照相比土壤中放線菌數(shù)量分別增加了26.5%，65.6%，135.1%。這可能與鹽脅迫下鈍化了吡蟲啉對放線菌的毒性，反而為其提供了生長的營養(yǎng)源有關。28d時，0.4，2 μg／g吡蟲啉處理組土壤中放線菌數(shù)量逐漸恢復到對照水平，10μg／g吡蟲啉依然對供試土壤中放線菌有顯著的刺激作用（p＜0.05）。這說明隨著培養(yǎng)時間的延長和吡蟲啉的降解，土壤中可供利用的碳源和能源逐漸減少，從而較低濃度吡蟲啉處理土壤中放線菌數(shù)量逐漸和對照趨于一致。

表2 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤細菌數(shù)量的影響

2.1.3 吡蟲啉對土壤真菌數(shù)量的影響 由表4可知，本實驗所供試的棉田土壤中真菌數(shù)量明顯偏少，這可能與所采集土壤的理化性質有關，經(jīng)測定本實驗供試土壤的pH為7.65，呈弱堿性，從而導致真菌數(shù)量少于中性和弱酸性土壤中真菌數(shù)量［14］。吡蟲啉對供試土壤中真菌數(shù)量影響不大，僅在7d和14d時，10μg／g吡蟲啉對土壤中真菌表現(xiàn)出一定的刺激作用，14d后各濃度吡蟲啉處理土壤中真菌數(shù)量和對照無顯著差異（p＜0.05）。在添加0.3%鹽土壤下，吡蟲啉對真菌的影響和不加鹽土壤真菌數(shù)量變化基本一致，這說明吡蟲啉對土壤中真菌數(shù)量的影響和土壤中鹽濃度關系較小。

表3 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤放線菌數(shù)量的影響

表4 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤真菌數(shù)量的影響

2.2 鹽脅迫下吡蟲啉對棉田土壤酶活性的影響

2.2.1 吡蟲啉對土壤堿性磷酸酶活性的影響 磷酸酶在土壤中以中性磷酸酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶三種形式存在，所在環(huán)境不同，磷酸酶也表現(xiàn)出不同的活性［15］。因為本實驗所用土壤為黃河三角洲棉田土壤，其鹽含量相對較高，土壤呈弱堿性。因此本實驗重點評價了吡蟲啉對堿性磷酸酶活性的影響。由圖1A可知，與對照相比，三個濃度的吡蟲啉只在21 d時對堿性磷酸酶有激活作用，且吡蟲啉的濃度越大，酶的活性越強，酶活性最大增加了14.9%；在7，14，28d時，吡蟲啉對堿性磷酸酶的活性無顯著性影響。這可能與供試土壤中P含量偏低有關［16］，同時也說明吡蟲啉在弱堿性環(huán)境下對堿性磷酸酶活性影響較小。當供試土壤中添加0.3%鹽時，0.4，2μg／g的吡蟲啉在整個試驗周期內(nèi)對堿性磷酸酶活性的影響與對照相比無顯著性變化；但10μg／g吡蟲啉處理組土壤中堿性磷酸酶活性在4個取樣時間點均顯著提高（p＜0.05），酶活性增加了8.8%～12.9%（圖1B）?？梢酝茰y相對高濃度鹽的存在改變了土壤環(huán)境，從而使吡蟲啉對堿性磷酸酶活性的影響發(fā)生改變，但是不會對其產(chǎn)生抑制作用。

2.2.2 吡蟲啉對土壤脲酶活性的影響 脲酶作為唯一催化尿素在土壤中的轉化和生化作用的酶，與土壤生物化學循環(huán)中的氮循環(huán)密切相關，氨作為植物氮素營養(yǎng)來源之一是脲酶水解尿素而成，如果土壤中脲酶活性過低，將會影響土壤中尿素的利用率，若活性過高，會造成植物的氨中毒，對土壤肥力和作物的生長也不利［17］。由圖2A 可知，與對照相比，0.4，2μg／g的吡蟲啉在7，14d時對脲酶活性無顯著影響，在21，28d時有顯著的激活作用（p＜0.05），且濃度越大激活作用越強，脲酶活性最大分別提高了6.2%和9.7%；10μg／g吡蟲啉處理組在7，14d時土壤中脲酶活性顯著高于對照水平（p＜0.05），酶活性增加了12.9%，10.4%，而在21，28d酶活性低于對照水平，酶活性分別降低了14.7%，4.5%。由于不同土壤肥力條件下，不同殺蟲劑對土壤脲酶的影響效果不一樣，從本實驗結果來看，可以推測吡蟲啉對脲酶活性有刺激作用，且濃度越大，尿素水解高峰期出現(xiàn)的越早，高濃度吡蟲啉的降解產(chǎn)物可能對脲酶活性有抑制作用，從而在試驗后期脲酶的活性有所降低，這與文獻報道的吡蟲啉對大棚土壤脲酶活性影響的結果相似［18］。當土壤中添加0.3%鹽時，與對照相比，三個濃度的吡蟲啉處理只在14d對脲酶活性有明顯的抑制作用（p＜0.05），且與農(nóng)藥的濃度呈正相關，酶活性分別降低了5.8%，21.4%，32.6%；其他時間脲酶活性無顯著性變化（圖2B）。可以看出在添加0.3%鹽脅迫下，吡蟲啉對脲酶活性的影響明顯降低，這說明鹽的存在鈍化了吡蟲啉對土壤中微生物的影響從而降低了對脲酶活性的影響。

圖1 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤堿性磷酸酶活性的影響

圖2 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤脲酶活性的影響

2.2.3 吡蟲啉對土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響 β－葡萄糖苷酶也是土壤中重要的酶之一，其被認為是纖維素降解中最重要的一種酶，與土壤碳代謝密切相關，它的酶促產(chǎn)物——葡萄糖是植物、微生物的營養(yǎng)源，因此β－葡糖苷酶活性可以表征土壤生物學活性強度［19］。本研究結果表明，在未加鹽的土壤中，0.4μg／g的吡蟲啉對β－葡萄糖苷酶活性沒有影響，2，10μg／g吡蟲啉對酶活性有顯著的抑制作用（p＜0.05），酶活性降低了9.2%～17.7%，表現(xiàn)出一定的毒性作用（圖3A）。當土壤中添加0.3%鹽時，三個濃度的吡蟲啉只在14d對β－葡萄糖苷酶有顯著的激活作用（p＜0.05），酶活性分別增加了15.1%，19.6%，13.4%（圖3B），整個試驗周期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)有抑制作用，這說明鹽的存在能改變吡蟲啉對土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響，主要表現(xiàn)為可以減小其對β－葡萄糖苷酶的毒性。但該推測還需進一步驗證。

圖3 鹽脅迫下吡蟲啉對土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響

3 結論

根據(jù)以上實驗結果可知，吡蟲啉施用前期對細菌生長有促進作用，后期有抑制作用，農(nóng)藥的濃度越大，后期的抑制作用越強；添加鹽時，后期的抑制作用消失，只表現(xiàn)出對細菌的促進作用。吡蟲啉對放線菌有抑制作用，且濃度越大抑制作用越強，作用時間越長；添加鹽時，吡蟲啉在前期對放線菌有促進作用，后期低濃度處理的促進作用消除。吡蟲啉在鹽脅迫下對真菌影響不大；在添加鹽和不添加鹽的土壤中，吡蟲啉對酶活性的影響也不相同。吡蟲啉對堿性磷酸酶和脲酶有激活作用，添加鹽時，高濃度的吡蟲啉對堿性磷酸酶依然有激活作用，而吡蟲啉對脲酶只有短暫的抑制作用；吡蟲啉對β－葡萄糖苷酶有抑制作用，而添加鹽時，吡蟲啉對其則表現(xiàn)出激活作用；但實驗后期兩種條件下吡蟲啉對土壤微生物和土壤酶的影響逐漸消失，說明0～10μg／g吡蟲啉對黃河三角洲地區(qū)棉田土壤環(huán)境是安全的。

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