高氧對(duì)新生小鼠視網(wǎng)膜谷氨酸釋放的影響*

彭振宇，高 玲，彭湘萍

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.湘西自治州人民醫(yī)院，吉首大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，湖南 吉首 416000；3.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

高氧對(duì)新生小鼠視網(wǎng)膜谷氨酸釋放的影響*

彭振宇1,2，高 玲1，彭湘萍3

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.湘西自治州人民醫(yī)院，吉首大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，湖南 吉首 416000；3.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

為研究新生小鼠高氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度的變化及其機(jī)制，探討谷氨酸在高氧視網(wǎng)膜損傷中的作用，實(shí)驗(yàn)組將新生小鼠置于體積分?jǐn)?shù)為95%的高氧環(huán)境中造成視網(wǎng)膜損傷，對(duì)照組將新生小鼠置于正常空氣中，HE染色觀察視網(wǎng)膜損傷情況，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)視網(wǎng)膜谷氨酸(Glu)摩爾質(zhì)量濃度變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)視網(wǎng)膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)與谷氨酰胺合成酶(GS)mRNA表達(dá)情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空氣對(duì)照組比較，高氧處理組視網(wǎng)膜受損，視網(wǎng)膜Glu摩爾質(zhì)量濃度增加，GLAST和GS mRNA表達(dá)下降(P<0.05).高氧可導(dǎo)致新生小鼠視網(wǎng)膜的谷氨酸增高，其機(jī)制與GLAST和GS mRNA表達(dá)下降有關(guān).谷氨酸增加可能是高氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的原因之一.

高氧；谷氨酸；視網(wǎng)膜；新生；小鼠

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(Retinopathyofprematurity，ROP)是一種形成機(jī)制未明的視網(wǎng)膜增值性病變，致盲率高.其發(fā)生與早產(chǎn)兒吸高濃度氧氣有密切關(guān)系[1].谷氨酸(glutamate，Glu)是視網(wǎng)膜主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),過(guò)多的谷氨酸通過(guò)激活谷氨酸受體可引發(fā)興奮性毒性作用，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)L-谷氨酸/L-天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(L-glutamate/L-aspartate transporter，GLAST)攝取谷氨酸，在細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)作用下將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?，?duì)維持細(xì)胞外谷氨酸的正常水平發(fā)揮重要作用.目前，高氧是否影響新生小鼠視網(wǎng)膜谷氨酸變化未見(jiàn)報(bào)道.筆者分析了在高氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度(單位質(zhì)量所含谷氨酸物質(zhì)的量，單位：mol/g)變化及其相關(guān)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1模型制備及分組

健康的成年昆明小鼠，由湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供.雌雄合籠制備孕鼠，孕鼠順產(chǎn)新生小鼠，出生后隨機(jī)分為空氣對(duì)照組和高氧處理組，每組25只.空氣對(duì)照組置于正常空氣中，高氧組小鼠置于氧體積分?jǐn)?shù)大于等于95%的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，每天監(jiān)測(cè)氧濃度3次，鈉石灰吸收CO2.每天開(kāi)箱1次，檢查情況，更換墊料.高氧處理5 d后置于正?？諝庵? d.

1.2HE染色觀察視網(wǎng)膜改變

每組4只小鼠，斷頭處死，取雙眼眼球置于質(zhì)量濃度為0.04 g/mL多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，觀察視網(wǎng)膜病變.

1.3谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度測(cè)定

每組15只小鼠，每3只小鼠6個(gè)眼球?yàn)?個(gè)樣本.取眼球后置于冰上，剪除角膜和玻璃體，研磨，制備質(zhì)量濃度為0.1 g/mL組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定340 nm吸光度值,計(jì)算Glu摩爾質(zhì)量濃度.

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

每組6只小鼠,每2只小鼠4個(gè)眼球的視網(wǎng)膜為一個(gè)檢測(cè)樣本.取眼球后，立即置于液氮并研磨，Trizol法提取總RNA，各標(biāo)本取0.5g總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.GLAST引物序列上游5-CTCTCCTCTACTTCCTGGTA-3，下游5-GTGGCTGTGATGCTTATTG-3；GS引物序列上游5-GGGGTGATAGCAACCTTTGA-3，下游5-ACTGGTGCCTCTTGCTCAGT-3；內(nèi)參GAPGH，引物序列上游 5-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3，下游5-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3；PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為301,151,233 bp.PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性4 min，94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min繼續(xù)延伸.反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物行質(zhì)量濃度0.02 g/mL瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶拍照并加以分析，以各組目的基因與內(nèi)參基因的吸光度值的比值比較目的基因mRNA表達(dá)差異,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1視網(wǎng)膜改變

視網(wǎng)膜改變?nèi)鐖D1所示.HE染色顯示：空氣對(duì)照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)整，內(nèi)外核層細(xì)胞核染色均勻，邊界清晰，未見(jiàn)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞.高氧處理組顯示：神經(jīng)細(xì)胞腫脹變圓，結(jié)構(gòu)欠清，可見(jiàn)大量突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核.

圖1 視網(wǎng)膜改變(HE染色 ×200)

2.2谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度變化

圖2 新生小鼠視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度比較

空氣對(duì)照組視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度為(6.45±1.26)μmol/g，高氧處理組視網(wǎng)膜谷氨酸增高為(14.75±1.64) μmol/g，較空氣對(duì)照組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=5)，如圖2所示.

2.3GLAST和GSmRNA表達(dá)變化

凝膠電泳結(jié)果顯示，如圖3a)，233 bp為內(nèi)參GAPDH條帶，301 bp為GLAST條帶，高氧處理組GLAST表達(dá)條帶減弱.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，高氧組GLAST mRNA表達(dá)的相對(duì)灰度值與空氣對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).如圖3b)，233 bp為內(nèi)參GAPDH條帶，151 bp為GS條帶，高氧處理組GS表達(dá)條帶減弱.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，高氧組GS mRNA表達(dá)的相對(duì)灰度值與空氣對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

a GLAST mRNA7

b GS mRNA7

3 結(jié)論與分析

(1) 谷氨酸是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括視網(wǎng)膜在內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與機(jī)體正常狀態(tài)下的一系列重要生理活動(dòng).谷氨酸在神經(jīng)元細(xì)胞外的低濃度維持主要依賴(lài)于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體作用，谷氨酸進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為谷氨酰胺對(duì)抗興奮毒性而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用.谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度的異常參與了多種缺血缺氧視網(wǎng)膜疾病的病理過(guò)程過(guò)程.相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物急性高眼壓中視網(wǎng)膜谷氨酸水平明顯增高[2]；慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度升高與GLAST和GSmRNA表達(dá)下降有關(guān)[3]；視網(wǎng)膜缺血再灌注中谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度升高，可能是視網(wǎng)膜損傷的機(jī)制之一[4]；高糖誘導(dǎo)的大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷也與谷氨酸的釋放增多有關(guān)[5].

(2) 早產(chǎn)兒、低體重兒呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完善，氧療是臨床治療的重要手段.早產(chǎn)兒暴露于高氧環(huán)境中，視網(wǎng)膜血管發(fā)生痙攣缺血，到吸氧停止后，可產(chǎn)生新生血管和增殖性視網(wǎng)膜病變，嚴(yán)重者可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離失明.出生后小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育還未成熟，通過(guò)高氧刺激，可出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)的ROP改變[6].通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究高氧處理對(duì)視網(wǎng)膜谷氨酸的影響及其機(jī)制，探討高氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的原因具有一定的現(xiàn)實(shí)意義.

(3) 研究結(jié)果表明，高氧處理新生小鼠可導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)損傷組視網(wǎng)膜谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度增加，過(guò)多的谷氨酸在細(xì)胞間隙蓄積結(jié)合谷氨酸受體產(chǎn)生興奮性毒性是造成視網(wǎng)膜受損的原因之一.高氧導(dǎo)致的GLAST mRNA表達(dá)下降使細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST減少，谷氨酸不能快速地?cái)z入細(xì)胞內(nèi)；高氧導(dǎo)致的GS mRNA表達(dá)下降使谷氨酸代謝為谷氨酰胺能力減弱，提示GLAST和GS mRNA表達(dá)下降是細(xì)胞外谷氨酸摩爾質(zhì)量濃度增加的機(jī)制之一.高氧處理過(guò)程中谷氨酸的代謝是下一步擬研究的內(nèi)容與方向.

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(責(zé)任編輯 陳炳權(quán))

EffectandMechanismofGlutamateReleaseatHyperxiaInducedRetinalInjuryinNewbornMice

PENG Zhenyu1,2，GAO Ling1，PENG Xiangping3

(1.Department of Ophthalmology，the Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011，China;2.Department of Ophthalmology，the People’s Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture，Jishou 416000，Hunan China;3.Medical College of Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

The concentration change and mechanism of glutamate at hyperxia induced retinal injury in newborn mice retinal injury are explored.The experimental group was put in 95% hyperxia environment to induce retinal damage,and the control groups in normal air.HE staining was used to observe retinal injury,ELIASA to detecte the glutamate (Glu) concentration,and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) to analyze the expression of retinal glutamate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) mRNA.The results showed that,compared with control group,hyperxia treatment group with retinal injury showed the increased Glucontent,and decreased GLAST and GS mRNA expression.It thus can be concluded that hyperxia can lead to the increase of retinal glutamate in newborn mice,the mechanism of which was associated with decreased GLAST and GS mRNA expression.Glutamate increase may be one of the reasons for the hyperxia induced retinal injury.

hyperxia;glutamate;retina；newborn;mice

1007-2985(2014)02-0090-04

2013-12-26

彭振宇(1976-)，湖南保靖人，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院碩士生，湘西自治州人民醫(yī)院副主任醫(yī)師，主要從事玻璃體與視網(wǎng)膜疾病研究

高 玲(1968-)，女，湖南懷化人，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院教授，博士生導(dǎo)師，主要從事眼疾病的發(fā)病機(jī)制與診療研究.

R774.1

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.020