高分辨率熔解曲線法在BIM基因2,903 bp片段插入/缺失檢測(cè)中的應(yīng)用

夏金晶 白浩 熊麗紋 李蓉 顏波 邵敏華 韓寶惠

BIM基因是編碼細(xì)胞凋亡基因BCL2蛋白家族中的一個(gè)成員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1,2]。研究[3]表明BIM基因外顯子3和外顯子4之間存在的2,903 bp的缺失會(huì)造成BIM亞型BH3結(jié)構(gòu)缺乏表達(dá)。而這種缺乏表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌癥患者對(duì)部分治療藥物有更強(qiáng)的耐藥性。在癌癥患者體內(nèi)，這種刪除與藥物反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間相關(guān)聯(lián)，并且能夠被用來(lái)預(yù)測(cè)患者在沒(méi)有疾病惡化時(shí)的存活時(shí)間。攜帶這種刪除突變的那些患者的平均無(wú)疾病惡化存活期限為大約6個(gè)半月時(shí)間，而沒(méi)有這種突變的那些患者則為將近12個(gè)月。因此BIM缺失的檢測(cè)對(duì)于癌癥患者有相當(dāng)重要的意義。

在本研究中，建立了一種高分辨率熔解曲線法（high resolution melting, HRM）來(lái)檢測(cè)BIM基因片段缺失在肺癌患者中的發(fā)生情況，并用傳統(tǒng)PCR方法對(duì)HRM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，建立了一種高分辨率熔解曲線法對(duì)于BIM基因2,903bp片段插入/缺失檢測(cè)是一種靈敏、準(zhǔn)確、快速、高通量的方法。

1 材料與方法

1.1 病例樣本 共檢測(cè)30例肺癌樣本。30例正常對(duì)照樣本。其中30例肺癌樣本來(lái)自于上海市胸科醫(yī)院2012年8月-2013年8月入院治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者（IIIa期-IV期）?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)后，抽取5 mL外周血，使用EDTA抗凝管進(jìn)行保存。30例正常對(duì)照樣本來(lái)自上海市徐匯區(qū)社會(huì)體檢人群，俱簽署知情同意。

1.2 DNA提取 基因組DNA采用濃鹽法[4]進(jìn)行抽提。取200 μL全血放入1.5 mL離心管內(nèi)，加入裂解液STE（Tris-Hcl 10 mM, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM）410 μL，10%SDS 90 μL，pk 5 μL在65oC消化15 h左右。充分消化后加入300 μL飽和NaCl輕搖3 min。加氯仿340 μL混勻后12,000 rmp離心20 min。將上清液吸入另一離心管中，加異丙醇650 μL，4oC，12,000 rpm離心16 min。倒掉異丙醇加500 μL 75%乙醇，4oC 12,000 rpm離心5 min，重復(fù)兩次后烘干沉淀，加入70 μL Mili Q水溶解。提取的基因組DNA經(jīng)Nanodrop定量，測(cè)定260/280值后，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中人類BIM基因序列（Gene ID: 10018），設(shè)計(jì)HRM上游引物：ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG，HRM下游引物1：CCCAACCTCTGACAAGTGACC，HRM下游引物2：TTGGTGGGAATGTAAAATGGC。HRM引物設(shè)計(jì)原理見(jiàn)圖1。普通PCR上游引物：AATACCACAGAGGCCCACAG ，普通PCR下游引物：GCCTGAAGGTGCTGAGAAAG。測(cè)序上游引物：CATAAATACCACAGAGGCCCACA GC，測(cè)序下游引物1：CCCAACCTCTGACAAGTG ACC，測(cè)序下游引物2：TTGGTGGGAATGTAAA ATGGC。

1.4 HRM檢測(cè) PCR擴(kuò)增和高通量熔解曲線分析在LightCycler? 480 II 熒光定量PCR儀（Roche）上進(jìn)行，采用384孔反應(yīng)模塊。試劑使用LightCycler? 480 High Resolution Melting Master試劑盒，反應(yīng)體系為10 μL，內(nèi)含5 ng-10 ng基因組DNA、1×Master Mix、3.0 mmol/L MgCl2，引物濃度為0.2 μmol/L。

PCR擴(kuò)增采用降落（touchdown）模式：95oC預(yù)變性10 min，95oC變性15 s，65oC-55oC退火（每循環(huán)下降0.5oC）15 s，72oC延伸20 s的程序進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。之后再按95oC變性15 s，55oC退火15 s，72oC延伸20 s的程序進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解步驟在PCR循環(huán)結(jié)束后立即進(jìn)行，程序?yàn)椋荷郎刂?5oC 15 s，然后降溫至40oC 1 min，再升溫至65oC 1 s。從65oC連續(xù)升溫至95oC的過(guò)程中進(jìn)行熒光收集（20次/oC）。最后，降溫至40oC。高分辨率熔解曲線分析用LightCycler? 480的Gene Scanning軟件（1.5 version）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 HRM檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化 根據(jù)BIM基因缺失情況與序列信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。同一個(gè)反應(yīng)中存在兩對(duì)引物，可能擴(kuò)增出兩種不同的產(chǎn)物。為使兩種產(chǎn)物都得到較好的擴(kuò)增，采取了降落（touchdown）模式對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。缺失型模板的擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型模板擴(kuò)增產(chǎn)物相比GC含量略低，解鏈溫度也較低。分析結(jié)果顯示，野生型和缺失型的模板所產(chǎn)生的熔解曲線可見(jiàn)明顯差異，相應(yīng)的Tm值相差約2.5oC（圖2）。在HRM的靈敏度檢測(cè)中，分析評(píng)估不同BIM突變濃度DNA的結(jié)果（ 0%、1%、2%、5%、10%、25%、50%稀釋和100%的突變體）。該HRM方法可以很容易區(qū)分突變含量為5%的樣本（圖3） ，比普通PCR以及直接測(cè)序更高 。

2.2 30例肺癌樣本、30例正常對(duì)照樣本BIM基因缺失檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用建立的HRM檢測(cè)法，對(duì)30例肺癌樣本，30例正常對(duì)照樣本進(jìn)行BIM基因缺失檢測(cè)。在30例肺癌樣本中發(fā)現(xiàn)純合缺失型樣本1例，雜合樣本7例，其余均為野生型樣本；在30例正常對(duì)照樣本中發(fā)現(xiàn)雜合樣本2例，其余均為野生型樣本。從以上純合缺失型、雜合缺失型、野生型樣本中各取2例進(jìn)行測(cè)序和普通PCR鑒定，普通PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

代表性的野生型、雜合缺失型和純合缺失型的HRM與普通PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，測(cè)序結(jié)果如圖5所示。圖4、5中a標(biāo)本檢測(cè)為野生型，b標(biāo)本檢測(cè)為雜合缺失型，c標(biāo)本檢測(cè)為純合缺失型。

3 討論

圖 1 HRM檢測(cè)BIM基因缺失引物設(shè)計(jì)原理Fig 1 The principle of the HRM detection BIM gene deletion‘s primer design

圖 2 野生型比缺失型的解鏈溫度要高。經(jīng)變換后的熔解曲線峰值溫度差值約為2.5 ℃，區(qū)分十分明顯（——野生型——缺失型）。Fig 2 The melting temperature of wild-type is higher than the deletion. Ater the data processing the significant difference of the melting curve peak temperature is about 2.5 ℃ (——wild type——deletion).

圖 3 HRM檢測(cè)BIM缺失靈敏度檢測(cè)。1: 0%；2: 50%；3: 25%；4: 10%；5:5%；6: 1%；7: 100%。Fig 3 Sensitivity of the high resolution melting (HRM) analysis for detecting the BIM deletion. 1: 0% mutant; 2: 50% mutant; 3: 25%mutant; 4: 10% mutant; 5: 5% mutant; 6: 1% mutant; 7: 100%.

圖 4 代表性野生型、雜合缺失型和純合缺失型的HRM與普通PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 4 The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' HRM and ordinary PCR detection

圖 5 代表性野生型、雜合缺失型和純合缺失型的測(cè)序結(jié)果Fig 5 The typical results of the the wild-type, heterozygous and homozygous' sequencing detection

HRM可以檢測(cè)擴(kuò)增模板中的序列變化。該方法是通過(guò)檢測(cè)與雙鏈DNA結(jié)合的飽和熒光染料在變性升溫過(guò)程中隨著DNA解鏈時(shí)游離到體系中發(fā)生的熒光強(qiáng)度的減弱而實(shí)現(xiàn)的。與傳統(tǒng)PCR以及測(cè)序方法相比較，此種方法可以在一步PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)，無(wú)需延伸、無(wú)需進(jìn)行電泳鑒定，有著快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、污染可能低的特性，而且只要是模板中有序列變化，都會(huì)使其熔解曲線發(fā)生變化，從而在高分辨率溶解曲線去得以體現(xiàn)，比傳統(tǒng)PCR以及測(cè)序更靈敏[5,6]。

HRM能檢測(cè)模板中存在的任何序列變化。這使得該方法不但可以檢測(cè)特定位點(diǎn)的突變，還能篩查整個(gè)擴(kuò)增序列的變化。

BIM基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)起著極為重要的作用[2,7]，在另外一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)BIM基因變異導(dǎo)致了某些患者無(wú)法受益于這些酪氨酸激酶抑制劑藥物。藥物耐受主要是BIM突變導(dǎo)致BIM蛋白生成受損。而使用BH3藥物修復(fù)BIM基因功能就可能克服兩種癌癥類型的TKI耐受[3]。以上研究表明，BIM是個(gè)癌癥耐藥基因。Ng等[3]的研究中對(duì)BIM基因上2,903 bp的indel的檢測(cè)使用的方法為瓊脂糖凝膠電泳方法，和本文闡述的HRM方法相比，凝膠電泳所需時(shí)間更長(zhǎng)、檢測(cè)需要開(kāi)放式進(jìn)行可能引入污染和交叉污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)凝膠成像使用肉眼觀察，如果PCR產(chǎn)物濃度較低會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤讀取。相比，HRM方法使用熒光染料檢測(cè)，靈敏度更高，原管檢測(cè)避免了開(kāi)管檢測(cè)可能引入的污染機(jī)會(huì)，PCR反應(yīng)完成后僅需要5 min-10 min進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)，更方便快捷。本研究建立的對(duì)BIM基因2,903 bp片段缺失的HRM是一種靈敏、準(zhǔn)確、高效、快速、低污染的檢測(cè)方法。