器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株的篩選及建立

周清華 祖玲玲 李潞 陳曉禾 陳曉峰 李洋 劉紅雨 孫芝琳

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌是男性死亡率和發(fā)病率均為首位，女性發(fā)病率第二位，死亡率第一位的腫瘤[1-7]。近30年來，全世界肺癌發(fā)病率和死亡率不斷增長，但總的治愈率卻沒有明顯提高，5年生存率低于15%[1,8-14]。肺癌高死亡率的主要原因是大約50%的患者就診時已有遠處轉(zhuǎn)移，30%-40%的患者在治療過程中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[15-18]。肺癌轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標志和生物學特征，也是導致治療失敗和死亡的最主要原因[2-7]。肺癌轉(zhuǎn)移是一個有多基因參與調(diào)控、涉及多信號通路、多階段、多步奏發(fā)生的復雜過程[7,9]。已有的研究證明：體外培養(yǎng)和建立人肺癌細胞系對于研究肺癌癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的分子機理、生物學特征，以及開發(fā)抗肺癌新藥等均有十分重要的理論和臨床意義[8,14-18]。研究肺癌轉(zhuǎn)移的有效方法是利用具有相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能、基因和信號調(diào)節(jié)途徑的肺癌細胞株作為天然對比材料[8]。等經(jīng)過多年對腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究，人們認識到腫瘤細胞異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關，其理論核心是：腫瘤本質(zhì)上是由多克隆異質(zhì)性細胞所組成，轉(zhuǎn)移之所以發(fā)生，主要是由于具有高轉(zhuǎn)移能力的克隆株細胞存在于腫瘤細胞群體之中。已有的研究[19-29]證明：肺癌與其他腫瘤一樣其遠處轉(zhuǎn)移具有器官特異性選擇。目前，國內(nèi)外已經(jīng)構建了前例腺癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移細胞株[19-29]，但迄今國內(nèi)外均無有關肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株的報道。為了篩選鑒定和建立具有器官特異性轉(zhuǎn)移的人肺癌細胞株，我們應有我們實驗室獨有的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981為材料，通過體內(nèi)外篩選以期篩選出具有靶向器官特異性侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細胞株，為進一步的研究肺癌靶向器官特異轉(zhuǎn)移提供科學可靠的細胞模型。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 ①母系高轉(zhuǎn)移肺癌細胞株：L9981-Luc。L9981-Luc是應用本實驗篩選的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981，轉(zhuǎn)染Luciferanse ，篩選鑒定后，細胞株穩(wěn)定表達Luciferanse的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株。②細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640。③細胞培養(yǎng)基：購自美國Sigma公司。④精制小牛血清：購自美國Gibico公司。⑤胰蛋白酶：購自Amresco公司。⑥原代細胞培養(yǎng)基：購自美國JIBICO公司⑦動物活體成像儀：IVIS200型，購自美國精若真公司。⑧倒置熒光相差顯微鏡：尼康TE-2000型，購自日本尼康公司。

1.2 主要研究方法 從液氮罐取出L9981-Luc細胞株，復蘇后，常規(guī)培養(yǎng)，等到細胞株貼壁生長良好后，將1×105母系肺癌細胞株L9981-Luc接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應用動物活體成像儀對荷裸鼠進行活體成像，觀察母系肺癌細胞株L9981-Luc在裸鼠體內(nèi)的成瘤性和遠處轉(zhuǎn)移情況。當活體成像觀察到母系肺癌細胞株L9981-Luc在遠處形轉(zhuǎn)移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉(zhuǎn)移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結），并子無菌條件下解剖出相應的肺癌器官特異性瘤結節(jié)。在無菌條件下，在培養(yǎng)基中將相應的肺癌器官特異性瘤結節(jié)切成細碎片，并進行器官特異性轉(zhuǎn)移的原代培養(yǎng)。當原代培養(yǎng)的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株貼壁生長良好后，將大部分原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株在液氮中凍存，將1×105原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株分別接種到裸鼠皮下腹股溝皮下，每周一次應用動物活體成像儀對荷裸鼠進行活體成像，觀察原代培養(yǎng)器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株在裸鼠體內(nèi)的成瘤性和遠處轉(zhuǎn)移情況。當活體成像觀察到在原代培養(yǎng)的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株在遠處形成轉(zhuǎn)移瘤后，處死裸鼠，在無菌情況下解剖出裸鼠的肺癌轉(zhuǎn)移器官（肺、大腦、脊柱和縱隔淋巴結），并子無菌條件下解剖出相應的肺癌器官特異性瘤結節(jié)。在無菌條件下，在培養(yǎng)基中將相應的肺癌器官特異性瘤結節(jié)切成細碎片，并進行器官特異性轉(zhuǎn)移的原代培養(yǎng)。經(jīng)過如此反復的蔣器官特異性轉(zhuǎn)移原代肺癌細胞株進行體內(nèi)外篩選后，篩選建立成功4株人器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株（篩選流程見圖1）。

圖1 高器官靶向特異性轉(zhuǎn)移潛能肺癌細胞株篩選流程圖Fig 1 Work flow of screening human lung cancer cell lines with high tissue-specific metastasis potential

2 結果

2.1 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株成瘤性及器官靶向轉(zhuǎn)移率比較 母系肺癌細胞株L9981-Luc為對照，4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株（L9981-LuM, L9981-LnM, L9981-BrM,L9981-BoM）為實驗組，分別接種裸鼠，評估器官特異性轉(zhuǎn)移在裸鼠體內(nèi)性成瘤率和器官特異性轉(zhuǎn)移百分比。每組5只裸鼠作為獨立的實驗，接種對照組和實驗組細胞株后每周進行裸鼠活體成像，8周后解剖取得肺，淋巴，脊柱，腦組織，并解剖出器官特異性轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移瘤，活體成像儀分析。結果 發(fā)現(xiàn)對照組中的5只小鼠的肺，淋巴，脊柱，腦均發(fā)生了肺癌轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移百分比均為100%。而實驗組L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM、L9981-BoM細胞株，均具有器官特異性轉(zhuǎn)移，但沒有發(fā)生其他器官轉(zhuǎn)移。L9981-LuM細胞株全部轉(zhuǎn)移到肺，5只裸鼠均發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移瘤，轉(zhuǎn)移百分比均為100%，而縱隔淋巴結，脊柱，大腦均沒有發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-LnM細胞株全部轉(zhuǎn)移到縱隔淋巴結，5只裸鼠中均發(fā)生了縱隔淋巴結轉(zhuǎn)移，而肺、脊柱和大腦均為發(fā)現(xiàn)有肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-BrM細胞株全部轉(zhuǎn)移到大腦，5只裸鼠均發(fā)生了大腦轉(zhuǎn)移，而肺、淋巴結和骨均未發(fā)現(xiàn)有肺癌轉(zhuǎn)移。L9981-BoM細胞株接種裸鼠后5只裸鼠全部發(fā)生了脊柱轉(zhuǎn)移，而肺、淋巴結、和大腦均未發(fā)現(xiàn)肺癌轉(zhuǎn)移（圖2，表1）。

圖2 第一代原代器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株轉(zhuǎn)移器官活體成像成像Fig 2 The living imaging of metastasized organs planted with the first generation of organ-specific metastasis lung cancer cell line

表 1 母系肺癌細胞株與4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株成瘤性及器官特異性轉(zhuǎn)移率比較Tab 1 comparison of tumorigenicity and organ-specific metastasis ability between the parent lung can cell line L9981 and the 4 organ-specific metastasis cell lines

2.2 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株細胞形態(tài)學 培養(yǎng)篩選所得人肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移潛能細胞株，分別通過100×、200×、40×顯微觀察其形態(tài)，與對照組細胞比較，形態(tài)均發(fā)生了不同程度的改變，其中L9981-BoM、L9981-BrM、L9981-LnM三株細胞株形態(tài)較之L9981-luc的不規(guī)則梭形均變化呈不同程度的圓形形態(tài)（圖3）。

2.3 人肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移細胞株轉(zhuǎn)移裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的活體成像結果 通過裸鼠腹股溝皮下種植篩選獲得的具有靶向器官特異性轉(zhuǎn)移潛能細胞，此后分別在1周、3周、6周活體成像分析其體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)所檢測腫瘤細胞在體內(nèi)普遍成瘤且發(fā)生了轉(zhuǎn)移，活體成像觀察的原位癌信號強弱與體內(nèi)生長時間呈正相關，體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞信號強弱同樣與時間呈正相關（圖4）。

3 討論

肺癌轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標志和的重要生物學特征，且是造成癌癥患者死亡的首要因素[2-6]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是由多因素參與、多基因調(diào)控，腫瘤細胞與靶器官相互作用的多階段復雜過程[7-10]。每個組織、器官都有自身的結構及微環(huán)境特點，腫瘤細胞侵入靶器官就必須應對環(huán)境的壓力，包括：氧氣和營養(yǎng)的缺乏、低pH、活性氧自由基和炎癥反應調(diào)節(jié)因子，經(jīng)過環(huán)境的選擇后，腫瘤細胞形成新的癌灶[12-20]。

圖3 母系與器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株形態(tài)學比較Fig 3 Comparison of morphology among the parent lung cancer cells and the organ-specific metastasis cells

腫瘤器官轉(zhuǎn)移具有器官特異性的，不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)移對不同靶器官的親和力往往不同，存在屬于其自身的特點。前列腺癌最最常見的轉(zhuǎn)移部位是骨，肝癌最常見的轉(zhuǎn)移器官為肺；乳腺癌常轉(zhuǎn)移到肺、骨和大腦；肺癌常轉(zhuǎn)移到大腦、淋巴結、骨、肝臟和腎上腺。目前，肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌引發(fā)高死亡率原因主要是因為肺癌發(fā)生了其它器官的轉(zhuǎn)移，比如腦、骨、脊柱、淋巴等。因此，深入研究肺癌器轉(zhuǎn)特異性轉(zhuǎn)移的分子機理及信號調(diào)節(jié)途徑，極有可能為肺癌轉(zhuǎn)移的預測、早期診斷和開發(fā)抑制/或逆轉(zhuǎn)的分子靶向藥物具有重要的理論意義和廣闊的臨床應用前景。然而，要研究肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移分子機制的最可靠方法是必須應用具有相同遺傳背景、不同器官特異性轉(zhuǎn)移的天然對比細胞株。正是基于上述科學問題，我們應用我們實驗室的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981為母系細胞株作研究材料，經(jīng)體內(nèi)外篩選，以期建立具有器官特異性轉(zhuǎn)移的肺癌細胞株。

圖4 器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株裸鼠活體成像Fig 4 The Living Imaging of the nude mice planted with organ-specific metastasis lung cancer cells

目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種人器官特異性轉(zhuǎn)移惡性腫瘤細胞株[22-29]。但是，迄今為止有關肺癌器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株的篩選鑒定的研究國內(nèi)外均無報道。因此，本課題組應用我們實驗室建立的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株為材料，通過體內(nèi)外的篩選鑒定，成功篩選建立了一個能特異性轉(zhuǎn)移到肺、縱隔淋巴結、骨和大腦的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞模型，并將特異性轉(zhuǎn)移到肺，淋巴，腦，脊柱的器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株，分別命名為L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM。隨后，我們應用裸鼠肺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移動物模型，活體成像技術和病理學技術對L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM的器官特異性轉(zhuǎn)移潛能進行了驗證。我們的研究結果證明：與母系肺癌細胞株L9981比較，L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM肺癌細胞株除均能在裸鼠體內(nèi)均成瘤外，還能特異性地轉(zhuǎn)移到肺、淋巴結、大腦和骨，而L998細胞株則除了能在裸鼠體內(nèi)成瘤外，還能百分之百地轉(zhuǎn)移到肺、淋巴結、大腦和骨。此外，通過顯微觀察，4株器官特異性轉(zhuǎn)移肺癌細胞株（L9981-LuM、L9981-LnM、L9981-BrM和L9981-BoM）與母系細胞株L9981比較，其形態(tài)學發(fā)生了顯著改變，呈不規(guī)則圓形或橢圓型形態(tài)。我們推測，這一形態(tài)的變化可能是肺癌細胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中，為了適應轉(zhuǎn)移靶器官的微環(huán)境，并在靶器官形成新的癌灶，以便存活生長而發(fā)生的表型變化，但是其分子機制和細胞信號調(diào)控途徑尚未完全明了，有待以后進行更深入的研究。