脂肪組織冰凍切片油紅O滴染法的建立

王肖燕，王金泉*，姚 剛*，張繼紅

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830063)

脂肪組織冰凍切片油紅O滴染法的建立

王肖燕1，王金泉1*，姚 剛1*，張繼紅2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830063)

為了提高脂肪組織冰凍切片的染色效果和效率，將傳統(tǒng)的脂肪組織石蠟切片油紅O染色法改進為冰凍切片油紅O滴染法，以用于冰凍脂肪組織脂肪細胞增殖、分化的研究和脂肪相關(guān)疾病快速病理診斷。新鮮脂肪組織液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱緩沖30 min，在-33℃或-34℃時進行冰凍切片，組織染色采用油紅O微量滴染法。本改良的油紅O滴染法能應用于冰凍脂肪組織切片染色，清楚地顯示脂肪細胞的形態(tài)和脂滴的分布，有助于脂肪組織增值分化的研究和相關(guān)疾病病理切片分析。該方法快速高效、染色清晰、不易脫片，效果良好，可明顯縮短實驗周期和減少試劑成本，可使脂肪組織冰凍切片和油紅O染色技術(shù)更廣泛的應用于脂肪組織相關(guān)的科學研究和病理診斷。

脂肪組織；冰凍切片；滴染；油紅O染色法

哺乳動物的脂肪組織包括白色脂肪和棕色脂肪，棕色脂肪到成年時僅占機體脂肪組織的極少比重。白色脂肪組織幾乎分布于整個機體，其中皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪為主要的貯存能量的部位，肌內(nèi)脂肪含量是肉質(zhì)的重要決定因素之一[1]。對脂肪組織的研究顯示，白色脂肪既是能量貯存器官，也是機體最大的內(nèi)分泌器官[2]。白色脂肪組織的過度沉積可導致肥胖、脂肪肝和心血管疾病[3]，脂肪過度沉積同時也會導致家畜肉質(zhì)下降[4]。因此，對脂肪沉積規(guī)律的研究被廣大畜牧工作者所關(guān)注，對脂肪發(fā)育和細胞分子機理的研究日趨增多和深入，而脂肪組織形態(tài)學的研究為脂肪細胞的增殖、分化發(fā)育提供了有力的科學依據(jù)。

脂肪組織形態(tài)學研究的傳統(tǒng)方法是通過石蠟切片和油紅O染色。石蠟切片與冰凍切片相比存在固定、脫水、浸蠟和包埋等過程，用時較長，且如果要顯示脂質(zhì)則固定時間需要2～5周[4]。而傳統(tǒng)的油紅O染色中常用60%異丙醇分化和缸染[5]，易導致脂肪細胞脫落。對于臨床上送檢的標本，在非成批樣本情況下按傳統(tǒng)方法操作，試劑和人力成本較高。本試驗運用冰凍組織切片機對脂肪組織冰凍切片技術(shù)進行了改進，并首次采用油紅O滴染法代替缸染，極大地減少了制片時間和試劑消耗，取得了較好的結(jié)果。在參加中國畜牧獸醫(yī)學會學術(shù)研討會時被很多研究者關(guān)注，因此我們將方法總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 脂肪樣品獲取

綿羊屠宰后30 min內(nèi)取尾脂、腎周脂和皮下脂等不同部位脂肪組織樣品，樣品大小為長×寬×高=5 mm×5 mm×20 mm，迅速置于液氮中，之后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱緩沖30 min，即可進行冰凍組織切片，或者從液氮中取出后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，以備重復切片使用。

1.2 主要試劑的配制

油紅O染色液：油紅O儲備液(BA4081，珠海貝索生物公司)60 mL，ddH2O 40 mL混合均勻，靜置10 min備用。蘇木素染液：蘇木精(BA4081，珠海貝索生物公司)0.5 g，鉀礬5 g，NaIO3 0.1 g加熱溶解于70 mL ddH2O中，待完全溶解后加入甘油30 mL和冰乙酸2 mL混合均勻過濾待用，使用時按照1∶20的比例稀釋。

1.3 脂肪組織冰凍切片

將液氮或-80 ℃超低溫冰箱中的脂肪組織樣品取出，轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱中緩沖30 min后，再置于冷凍組織切片機(Leica CM3050S，Leica Instrument GmbH，Germany)中，切片機冰凍箱內(nèi)溫度提前2 h預冷至-33 ℃或-34 ℃，用OCT包埋劑將組織固定到樣品托中心位置，待包埋劑發(fā)白后將樣品托固定到樣品臺固定器上。調(diào)節(jié)刀片和組織塊之間的距離，進行修片，當組織切面整齊，且可連續(xù)切出完整的組織切片時，將切片厚度調(diào)整為6 μm，去除前幾張切片，之后便可貼片。貼片用載玻片置于室溫下，且載玻片需提前用多聚賴氨酸處理，以防止染色時脫片，如做免疫組化實驗需用免疫組化專用載玻片。貼片后不易常時間暴露在室溫環(huán)境中，避免切片干燥，可置于-20 ℃冰箱中，在染色時提前取出自然晾干，待載玻片上無水汽時便可染色。

1.4 油紅O滴染法

取上述貼有脂肪組織切片的載玻片自然晾干，用移液槍將60%油紅O染色液300 μL左右(可視組織切片大小而加減)分別滴于切片上，室溫下反應7 min，緩慢傾斜去除染液(油紅O染液可回收)；滴加等量1%鹽酸水分化3 s；雙蒸水緩慢沖洗5 s，終止分化；蘇復染核30 s；自來水沖洗返藍1 min；阿拉伯膠封片。染色封固后的切片用數(shù)碼顯微拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用“平均數(shù) ± 標準誤”表示，統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，差異顯著性檢驗采用單因子方差分析(one-way ANOVA)，P< 0.05為差異顯著，P< 0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同部位脂肪組織冰凍切片油紅O滴染比較

采用脂肪組織冰凍切片油紅O滴染法，可見正常脂肪組織細胞形狀規(guī)則，染色均勻，細胞輪廓清晰，細胞核呈藍色貼于胞膜周邊，脂滴呈粉紅色、完整無脫落。不同部位脂肪組織染色效果相同，細胞形態(tài)大小清晰可辨(圖1)，可用于不同部位脂肪組織增殖分化的形態(tài)學比較。

圖1 阿勒泰大尾羊不同部位脂肪組織冰凍切片油紅O滴染法染色A.尾脂；B.皮下脂；C.腎周脂F(xiàn)ig.1 Oil red O drop staining on frozen section of adipose tissue in the Altay sheep.A.tail fat; B.subcutaneous fat; C.perirenal fat

2.2 阿勒泰大尾羊不同部位脂肪組織脂肪細胞面積的比較

用Advanced 3.2分析軟件對6只阿勒泰大尾羊的尾脂、腎周脂和皮下脂的脂肪細胞進行了測量和比較，分析結(jié)果顯示尾脂和皮下脂的脂肪細胞面積顯著高于腎周脂的脂肪細胞面積，而尾脂與皮下脂間的脂肪細胞面積無顯著差異。

3 討 論

脂肪組織由脂肪細胞和極少的結(jié)締組織構(gòu)成，脂肪細胞內(nèi)大部分被由甘油三酯形成的脂肪空泡所占據(jù)，細胞核和胞質(zhì)較少位于周邊[6]，這樣的組織結(jié)構(gòu)有別于肌肉和其他實質(zhì)器官，因此，其染色性質(zhì)具有特殊性。傳統(tǒng)的石蠟切片存在固定、脫水、浸蠟和包埋等過程，用時較長，且容易造成脂質(zhì)脫落[4,7]。如果要顯示脂質(zhì)則固定時間需要2～5周，耗時較長，不利于對相關(guān)疾病病理切片的及時診斷分析。而冰凍組織切片可以在較短的時間完成切片，一般熟練技術(shù)人員從采樣到染色環(huán)節(jié)僅需2 h左右。脂肪組織為特殊的結(jié)締組織，冰凍切片制作比較困難，有別于其他組織，需要注意的是切片前組織樣品一定要先在-20 ℃冰箱中緩沖約30 min左右，再包埋切片，并且切片機冰凍箱內(nèi)溫度需控制在一個較低的溫度。對于脂肪組織而言，溫度過高，組織塊硬度不夠，切片不容易成形，厚薄不均勻，影響切片的質(zhì)量。反之，溫度過低，會導致組織塊過硬，切片也容易碎裂。前期試驗中骨骼肌組織冰凍箱內(nèi)溫度控制在-20℃ ～ -22 ℃[8]，有文獻報道了乳腺、卵巢、子宮在-20 ～ -25 ℃；胃、腸在-18 ～ -20 ℃；甲狀腺、肝、腎、脾在-15 ℃左右[9]，也有文獻報道甲狀腺用-20 ～ -21 ℃，脂肪樣腫瘤用-25 ～ -30 ℃[10]。本研究表明，脂肪組織冰凍切片的溫度控制在-33 ℃ ～ -34 ℃，切片的厚度控制在6 ～ 8 μm時，切片質(zhì)量較好。

圖2 不同部位綿羊脂肪細胞面積的比較**表示與腎周脂相比差異極顯著(P<0.01)。Fig.2 Adipocyte area of fat tissues sheep** indicates significant difference from perirenal fat (P<0.01).

脂肪組織不僅是能量貯存器官，也是內(nèi)分泌器官，可以分泌激素和其他細胞因子，如瘦素、腫瘤壞死因子、前列腺素等[11]。在研究這些因子時常用到免疫組化技術(shù)，與石蠟切片相比冰凍組織切片可以完整的保留脂肪組織中的抗原和活性物質(zhì)，能夠更真實的反映脂肪細胞的分泌功能。因此，脂肪組織冰凍切片將會更加廣泛的應用于脂肪沉積調(diào)控機理的研究和臨床疾病的診斷中。

在脂肪沉積的研究中很多都是觀察脂肪細胞的形態(tài)和脂質(zhì)的分布，傳統(tǒng)的方法為油紅O染色[7]。但是在染色過程中，分別用50%乙醇或60%異丙醇洗滌切片[7,12]，這樣易導致切片脫落。由此，嘗試省略傳統(tǒng)染色中第一步洗滌步驟，發(fā)現(xiàn)最終并不影響染色質(zhì)量。此外，切好的切片在室溫環(huán)境放置時間過長也會導致脫落，因此要控制好切片的濕度。剛切完的切片在室溫環(huán)境中放置不易超過20 min，從-20 ℃冰箱取出的切片，用肉眼觀察切片上無水汽即可染色，不要過于干燥。脂肪組織冰凍切片染色的關(guān)鍵還是脫片和染色效果的問題，因此為了防止脫片、節(jié)省染料和精確的顯示脂質(zhì)的分布，我們采用了油紅O滴染法，并用1%的鹽酸水代替60%異丙醇分化組織。通過嘗試，用1%鹽酸水的刺激性小，且脂肪細胞不易脫落，不易產(chǎn)生沉淀。而用異丙醇易產(chǎn)生沉淀，并對眼睛、鼻子和咽喉產(chǎn)生輕微刺激，還可通過皮膚吸收對機體造成損害[7]。采用滴染法取代缸染，使每次染色試劑的使用量由數(shù)十毫升減少至數(shù)百微升。即使只有1例標本，也不會造成浪費。同時，防止了缸染時切片易脫落的弊端。

本方法能保持油紅O染色效果，在不同部位脂肪組織，均能清晰地顯示脂肪細胞的形態(tài)和脂質(zhì)分布，其效果穩(wěn)定，操作簡便，用時短；并用滴染法減少試劑用量，有效防止脫片，極大地降低試驗成本。

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DropMethodofOilRedOStainingonAdiposeTissueFrozenSection

WANG Xiao-yan1,WANG Jin-quan1*,YAO Gang1*,ZHANG Ji-hong2

(1.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.AnimalSanitarySupervisionInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830063,China)

In order to analyze the proliferation and differentiation of adipocytes,the traditional oil red O staining on paraffin section was modified as drop method on frozen section of adipose tissues and further used in cell proliferation and differentiation studies and rapid pathological diagnosis of fat-related diseases.First,fresh adipose tissues were frozen by liquid nitrogen and frozen adipose tissues shifted to -20℃ to be alleviated for 30 min.Then,serial frozen sections were cut,and stained with the drop method of oil red O staining.The morphology of adipocyte and the distribution of lipid droplets distinctly contributed to study of the proliferation,differentiation of adipocyte and analysis of the pathology on diseases.The drop method is very fast and efficient,and can significantly shorten the time of test and reduce reagent costs,thus making it widely used in scientific research and fast pathology diagnosis with adipose tissues.

adipose tissue; frozen sections; drop method; oil red O staining

2014-04-09，

2014-05-05

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金資助項目(2011211A026)

王肖燕(1988-)，女，新疆烏魯木齊人，在讀碩士，主要從事肉品質(zhì)質(zhì)量與安全研究方向。E-mail：2462235994@qq.com

*[通訊作者]王金泉(1975-)，男，新疆烏魯木齊人，副教授，碩士生導師，主要從事動物生長發(fā)育調(diào)控研究。 E-mail：wangjinquan163@163.com 姚 剛(1959-)，男，新疆烏魯木齊人，教授，博士生導師，主要從事動物生理學方面研究。E-mail：yaogang516@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0058-03