腎炎寧對IgA腎病大鼠尿蛋白和腎臟病理改變的影響

梁建英，陳欣華，王冬玉， 邊 東，郭登洲，高 艷(.河北省石家莊市第一醫(yī)院干部科，河北 石家莊 000；.河北省石家莊市第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 000；.河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心行政科，河北 石家莊 000；.河北省中醫(yī)院腎病科，河北 石家莊 0007；.河北唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 唐山 06000)

·論著·

腎炎寧對IgA腎病大鼠尿蛋白和腎臟病理改變的影響

梁建英1，陳欣華2，王冬玉3， 邊 東4*，郭登洲4，高 艷5
(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院干部科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心行政科，河北 石家莊 050011；4.河北省中醫(yī)院腎病科，河北 石家莊 050017；5.河北唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 唐山 065000)

目的探討腎炎寧對IgA腎病大鼠24h尿蛋白和腎臟病理改變的影響，觀察該方對IgA腎病的治療效果。方法將30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和腎炎寧組各10只，除正常組外其余各組復(fù)制IgA腎病模型。從造模后第9周開始腎炎寧組給予腎炎寧煎劑灌胃，正常組、模型組均灌服等量生理鹽水，共給藥8周。分別于造模前，造模后第6周末、8周末、12周末、16周末用代謝籠收集24h尿液，行24h尿蛋白定量測定。16周末處死大鼠，留取腎臟組織，觀察大鼠腎臟病理改變。結(jié)果造模第16周末，腎炎寧組大鼠24h尿蛋白定量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與8周末、12周末尿蛋白量比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下，正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小球系膜、基質(zhì)未見明顯異常改變；模型組可見腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多、系膜區(qū)增寬、部分腎小管發(fā)生空泡變性；腎炎寧組也有不同程度病理改變，但與模型組相比病變減輕。結(jié)論腎炎寧能減少IgA腎病大鼠24h尿蛋白定量,減輕腎組織病理損害。

腎小球腎炎，IgA；白蛋白尿;大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.021

IgA腎病又稱Berger病，是指腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主的一種原發(fā)性腎小球腎炎，臨床表現(xiàn)以血尿為主，伴或不伴有蛋白尿，是我國常見的腎小球疾病之一，也是終末期腎衰的主要原因之一,嚴(yán)重危害人們的身體健康。目前認(rèn)為IgA腎病是導(dǎo)致腎纖維化的主要因素。本研究探討腎炎寧對大鼠24h尿蛋白及腎組織腎臟病理改變的影響，觀察其對IgA腎病的治療效果，旨在為有效的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物：選取清潔級健康雄性SD大鼠30只(河北省實(shí)驗動物中心提供)，置于安靜的空調(diào)房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫保持在18～23℃之間，相對濕度保持在45%～55%之間，分裝到6只飼養(yǎng)籠中，每日更換墊料，開窗通風(fēng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)動物1周后用代謝籠留取尿液，用試紙條檢測尿蛋白、尿潛血均為陰性，根據(jù)體質(zhì)量排序，隨機(jī)分為正常組、模型組、腎炎寧組各10只。

1.2 實(shí)驗藥物：受試藥物包括黃芪、生地黃、茯苓、黨參、白術(shù)、白茅根、女貞子、墨旱蓮、川芎、三七粉、仙鶴草、甘草，由河北省中醫(yī)院提供，藥物水煎濃縮至含生藥3.9g/mL，放入瓶中密閉4℃存放備用，18.7g·kg-1·d-1灌胃。

1.3 主要試劑與儀器：牛血清白蛋白SBA由美國Sigma公司提供。葡萄球菌腸毒素B(staphyloccal enterotoxins B,SEB)由中國軍事科學(xué)研究院微生物流行病研究所提供。焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)由美國Amresco公司提供。Trizol由北京索萊寶生物科技有限公司提供。異丙醇由天津市博迪化工有限公司提供。瓊脂糖由上海GENE生物有限公司提供。勻漿器(JJ-1型定時電動攪拌器)由國華儀器廠提供。Sartorius由電子天平北京賽多利斯天平有限公司提供。水平電泳槽、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀均由北京市六一儀器廠提供。醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)由武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司提供。新鮮的雙蒸水中加入鹽酸,濃度為8.5mmol/L，即1 000mL雙蒸水中加入10%鹽酸3.2mL。1% BSA酸化水的制備,1g BSA加入1 000mL酸化水，4℃保存?zhèn)溆谩?% BSA緩沖液的制備，將1g BSA溶于100mL生理鹽水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 造模方法：除正常組小鼠自由飲食水外，其余2組均在其基礎(chǔ)上隔日口服含0.1% BSA的酸化水6周,6周后按10mg/kg每日1次定期尾靜脈注射1%BSA緩沖液,每周連續(xù)3d，于第8周按0.4mg/kg,每周1次,連續(xù)3周,復(fù)加尾靜脈注射SEB。正常組口服及注射同等量生理鹽水，于造模第9周開始給藥，每日1次，腎炎寧組給予中藥煎劑18.7g·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予相當(dāng)劑量的生理鹽水灌胃，各組共給藥8周。于16周末處死動物。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 24h尿蛋白定量：分別于造模前，造模后第6周末、8周末、12周末、第16周末將大鼠置于代謝籠中，禁食，自由飲水，收集24h尿液，雙縮脲法測定24h尿蛋白定量。

1.5.2 光鏡樣品及免疫組化樣品制備：取部分腎皮質(zhì)，4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3μm厚的石蠟切片，行六胺銀染色，觀察腎小球變化。石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃過夜，PBS沖洗，5min×3次，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30min，PBS沖洗，5min×3次，滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的工作液，37℃孵育10～30min，PBS沖洗，5min×3次，DAB顯色劑顯色3～15min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況：正常組大鼠飲食正常，反應(yīng)敏捷，被毛有光澤，體態(tài)充盈。其余2組在口服BAS緩沖液期間飲食、外觀都與正常組大鼠無差別。尾靜脈注射BAS后，2組大鼠出現(xiàn)倦怠，嗜睡，食欲減退等癥狀，3d后上述癥狀好轉(zhuǎn)。尾靜脈注射SEB后，模型組大鼠精神萎靡，少動抱團(tuán)，1周以后癥狀改善。

2.2 各組大鼠24h尿蛋白定量比較：造模第6周末，除正常組外，其余2組大鼠24h尿蛋白定量明顯升高，與正常組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模第8周末，除正常組外2組大鼠24h尿蛋白較第6周末升高(P<0.05)，但2組之間差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義。造模12周末，腎炎寧組大鼠的24h尿蛋白定量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模第16周末，腎炎寧組大鼠的24h尿蛋白定量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且與8周、12周尿蛋白量比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3組在組間、時點(diǎn)間以及組間與時點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

組別24h尿蛋白造模前造模6周末造模8周末造模12周末造模16周末正常組2．45±1．272．56±1．322．87±1．212．57±1．153．36±0．78模型組2．76±1．4612．78±2．9619．13±1．4721．72±1．4920．96±0．62腎炎寧組2．68±1．3913．11±2．0919．84±2．2817．85±2．2416．88±0．87組間F=1419．850 P<0．01時點(diǎn)間F=258．141 P<0．01組間·時點(diǎn)間F=64．162 P<0．01

2.3 病理檢查結(jié)果：光鏡下，正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小球系膜、基質(zhì)未見明顯異常改變；模型組可見腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多、系膜區(qū)增寬、部分腎小管發(fā)生空泡變性；腎炎寧組也有不同程度病理改變，但與模型組相比病變減輕。見圖1。

2.4 免疫熒光觀察：正常組腎小球系膜區(qū)無免疫復(fù)合物沉積，模型組可見免疫復(fù)合物沿腎小球系膜呈顆粒狀分布，腎炎寧組也有不同程度的免疫復(fù)合物沉積，但較模型組減輕。見圖2。

3 討 論

IgA腎病是最常見的腎小球疾病，本病臨床上表現(xiàn)為發(fā)作性或持續(xù)性肉眼血尿、鏡下血尿和(或)蛋白尿、高血壓、腎病綜合征及腎功能受損，部分病情嚴(yán)重者進(jìn)展為終末期腎病,其特征是腎活檢免疫病理顯示在腎小球系膜區(qū)以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，以腎小球系膜增生為基本組織學(xué)改變[1]。祖國醫(yī)學(xué)對血尿的研究歷史較為悠久，在中醫(yī)歷史文獻(xiàn)中的記載屬“尿血”、“溲血”范疇[2]。本病初期由于六淫外邪、濕毒或濕熱等毒邪熾盛傷腎，病情纏綿難愈，病程較長，久病致虛，久病必瘀[3]。歷代醫(yī)家在其著作里都曾對本病的發(fā)病原因進(jìn)行闡述。《素問·氣厥論》謂:“胞移熱于膀胱,則癃溺血”，提出了本病的病因為膀胱有熱；《金匱要略》指出:“熱在下焦者則尿血”，首次提出了“尿血”的病名；《痿論》又云:“悲哀太甚則胞絡(luò)絕,胞絡(luò)絕則陰氣內(nèi)動,發(fā)則心下崩,數(shù)溲血也”?！吨T病源候論》認(rèn)為:“勞損于腎,動傷經(jīng)絡(luò),又為風(fēng)冷所侵,血?dú)鈸舨?故腰痛也”。血尿多與熱有關(guān)，血尿的病機(jī)與熱、虛、瘀、外感風(fēng)熱之邪侵襲人體有關(guān)；思慮勞倦過度，損傷脾胃，致使氣血失和，濕熱內(nèi)聚，熱傷血絡(luò)，熱迫血妄行，則發(fā)?。荒I陰虧虛，陰虛內(nèi)熱，灼傷血絡(luò)而致尿血，而出血多伴有瘀滯，瘀血阻絡(luò)，血不循經(jīng)，則血尿不止；此外，邪熱下擾腎絡(luò)，則往往使血尿加重或反復(fù)?？傊琁gA腎病形成機(jī)制是非常復(fù)雜的。既有脾腎臟腑功能失調(diào)至氣陰兩虛，又有濕濁瘀血作祟。

根據(jù)IgA腎病“本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜”的發(fā)病機(jī)制而擬腎炎寧方，由黃芪、生地黃、黨參、茯苓、白術(shù)、白茅根、女貞子、墨旱蓮、川芎、三七粉、仙鶴草、甘草等藥物組成。方中黃芪既可補(bǔ)益宗氣，又可行氣活血，生地黃既可養(yǎng)陰生津，又可涼血止血，兩者共為君藥，共奏益氣養(yǎng)陰之效；黨參補(bǔ)氣生津，白術(shù)益氣利水，兩者相互配合可助君藥加強(qiáng)補(bǔ)氣之效；女貞子、墨旱蓮取二至丸之效，助君藥滋陰之功；茯苓既可益氣，又可利水消腫；白茅根清熱祛濕；三七粉、仙鶴草涼血止血；川芎活血行氣。諸藥配合標(biāo)本兼治，確能切中病機(jī)?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，黃芪主要成分為黃芪皂甙、黃芪多糖等，具有強(qiáng)心、利尿、提高機(jī)體免疫力、抗氧化、改善血流狀態(tài)等作用[4]；茯苓的主要化學(xué)成分為茯苓糖、茯苓素及麥角甾醇等，能調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎[5]。女貞子、墨旱蓮具有調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、改善血液流變性、抗炎等作用[6]。川芎的有效成分主要有揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸等，它能抗氧化、抗過敏、改善血流狀態(tài)、增加微循環(huán)、提高機(jī)體免疫力。白茅根的有效成分包括三萜類、黃酮、內(nèi)酯類、糖類等，有利尿、抗炎、止血、抗菌及免疫調(diào)節(jié)等作用。三七主要成分為三七總皂苷，還含有黃酮、三七素、揮發(fā)油成分，具有抗凝、抗纖維化、抗炎、抗衰老、調(diào)節(jié)血管收縮、降壓等功能。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，腎炎寧能改善IgA腎病大鼠的一般情況，減少24h尿蛋白定量，改善腎臟病理變化，延緩IgA腎病的進(jìn)程，進(jìn)而緩解腎臟損傷的程度。(本文圖見封三)

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(本文編輯：許卓文)

2014-06-19；

2014-07-09

梁建英(1971-)，女，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事老年疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：dabc1234@qq.com

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