反相高效液相色譜法測定決明降脂片中大黃素和大黃素甲醚的含量

律 濤，劉 敏，賈海紅，郎書會(huì)，樊淑彥*(.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 05007；.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析化學(xué)教研室，河北 石家莊 05007)

·論著·

反相高效液相色譜法測定決明降脂片中大黃素和大黃素甲醚的含量

律 濤1，劉 敏2，賈海紅2，郎書會(huì)2，樊淑彥2*
(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析化學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的建立測定決明降脂片中大黃素和大黃素甲醚含量的反相高效液相色譜法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)。方法采用RP-HPLC測定大黃素和大黃素甲醚的含量。色譜柱為Kromasil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-四氫呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)；柱溫為25℃；流速為1.0mL/min；檢測波長為254nm；進(jìn)樣量20μL。結(jié)果在選定的色譜條件下大黃素和大黃素甲醚的保留時(shí)間分別在6.9min、11.8min，具有良好的分離度和穩(wěn)定性。大黃素回歸方程為Y=3.31×104X-4.63×103(R=0.999 7)，進(jìn)樣量在3.12～9.4mg/L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，樣品回收率為102.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation,RSD)值為1.7%(n=9)；大黃素甲醚回歸方程為Y=2.35×104X+8.80×103(R=0.999 8)，進(jìn)樣量在2.10～10.5mg/L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，樣品回收率為104.7%，RSD值為1.3%(n=9)。結(jié)論RP-HPLC操作可靠、準(zhǔn)確，適用于決明降脂片中大黃素和大黃素甲醚的含量測定。

色譜法，高壓液相；決明降脂片；大黃素；大黃素甲醛

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.014

決明降脂片是由決明子、茵陳、何首烏、桑寄生、維生素C、維生素B2、煙酸組成，具有降血脂、降血清膽固醇功能，用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病或慢性肝炎所引起的高脂血癥、血清膽固醇增高癥[1]。目前，國內(nèi)已報(bào)道反相高效液相色譜法(reversedphasehighperformanceliquidchromatography,RP-HPLC)法對決明降脂片中維生素C、維生素B2和煙酸的含量測定[2-4]，薄層色譜法對其中的何首烏、桑寄生、茵陳、決明子進(jìn)行定性鑒別，RP-HPLC法對決明子、何首烏中的大黃素以及何首烏中活性成分2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖的含量測定，但未見對大黃素甲醚進(jìn)行測定。本研究采用RP-HPLC法同時(shí)對決明降脂片中大黃素和大黃素甲醚進(jìn)行含量測定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，LC98-Ⅱ型，UV98-Ⅱ可變波長紫外可見分光檢測器，P98-Ⅱ高壓輸液泵，T-98型柱溫箱，北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；N-2000雙通道色譜工作站，浙江大學(xué)智能信息工程研究所；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；決明降脂片，通化鴻茂藥業(yè)有限公司，批號120501；大黃素對照品、大黃素甲醚對照品，均購于中國藥品生物制品檢定所(批號110756-200110、110758-200610)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相，甲醇-四氫呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)；柱溫，室溫；流速，1.0mL/min；檢測波長，254nm；進(jìn)樣量，20μL；大黃素和大黃素甲醚的保留時(shí)間分別在6.9min和11.8min(圖1)。

圖1 決明降脂片中大黃素、大黃素甲醚的RP-HPLC色譜圖

A.對照品；B.樣品；C.陰性對照

Figure1RP-HPLCofemodinandphyscionofJuemingJiangzhiTablets

A.Referencesubstances;B.Samples;C.Thesamplewithoutemodinandphyscion

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)：在上述色譜條件下，大黃素和大黃素甲醚與相鄰雜質(zhì)峰分離良好(分離度均>1.5)，理論塔板數(shù)不低于3 000。供試品中大黃素和大黃素甲醚的色譜峰與相鄰色譜峰均達(dá)到基線分離。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)：在上述色譜條件下，對陰性對照品溶液進(jìn)樣分析，將所得色譜圖與樣品色譜圖進(jìn)行比較，可見決明降脂片中其他物質(zhì)對待測組分含量測定不構(gòu)成干擾[5-6]。

2.4 供試品溶液的制備：取本品20片，除去包衣，稱質(zhì)量，計(jì)算平均片質(zhì)量，研細(xì)，精密稱定約0.5g，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的量，精密量取10mL，水浴揮干乙醇，殘?jiān)蒙V甲醇溶解，定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.5 對照品溶液的制備：分別精密稱取大黃素和大黃素甲醚對照品適量，各置25mL量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解并定容，得大黃素對照品溶液濃度為51.2mg/L，大黃素甲醚對照品溶液濃度為105mg/L，作為混合對照品溶液。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL混合對照品溶液分別置10mL量瓶中并稀釋至刻度，得到一系列質(zhì)量濃度溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣20μL，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。大黃素回歸方程為Y=3.31×104X-4.63×103(R=0.999 7)(n=5)，大黃素在3.12～9.4mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；大黃素甲醚回歸方程為Y=2.35×104X+8.80×103(R=0.999 8)(n=5)，大黃素甲醚在2.10～10.5mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度：精密吸取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20μL，測定峰面積積分值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)值。大黃素RSD為0.62%，大黃素甲醚RSD為0.62%，均<2.00%，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性：取供試品溶液，按上述色譜條件分別在0、2、4、8、12h測定峰面積。測得大黃素峰面積RSD為2.4%，大黃素甲醚峰面積RSD為1.5%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性：取同一批樣品(批號120501)5份，按“2.4”項(xiàng)下制備并測定。計(jì)算大黃素峰面積RSD為0.81%(n=6)，大黃素甲醚峰面積RSD為1.7%(n=6)，實(shí)驗(yàn)表明重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率：精密稱取已知含量的9份決明降脂片0.5g，按80%、100%、120%低、中、高3種濃度分別加入等量的大黃素和大黃素甲醚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法制備并測定，計(jì)算大黃素平均回收率為102.1%(n=9)，RSD為1.7%，大黃素甲醚平均回收率為104.7%(n=9)，RSD為1.3%。

2.11 最低檢測限：在信噪比≥3時(shí)，最低檢測限分別為大黃素0.624mg/L，大黃素甲醚3.88mg/L。

2.12 樣品測定結(jié)果：取決明降脂片樣品(批號120501)3份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備并測定。3份樣品中大黃素的含量分別為0.370、0.369、0.378mg/g，大黃素甲醚的含量分別為0.266、0.258、0.268mg/g。

3 討 論

3.1 提取工藝的確定：考察了不同濃度的乙醇對樣品提取率的影響，分別用25%、50%、75%、95%、100%的乙醇進(jìn)行提取，結(jié)果表明低濃度的乙醇提取不完全，無水乙醇提取效果很差，故選擇95%乙醇作為提取溶劑[7]。樣品分別用10、20、30、40、50min超聲處理，考察結(jié)果表明超聲30min后，2種指標(biāo)成分已基本提取完全，各成分的含量無明顯變化，所以選擇超聲30min為最佳提取時(shí)間[8]。

3.2 檢測波長的確定：據(jù)文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道，大黃素和大黃素甲醚在紫外檢測中的最大吸收波長均254nm，為了提高各成分的檢測靈敏度且能被同時(shí)測定，用254nm檢測時(shí)各成分峰形最佳，分離度好，故選擇254nm為檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇：改變流動(dòng)相中甲醇、1%磷酸緩沖液和四氫呋喃的配比，分離效果理想且流動(dòng)相處理方法簡單易行，因此確定流動(dòng)相為甲醇-四氫呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)[12]。

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(本文編輯：許卓文)

REVERSEDPHASEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYFORDETERMINATIONOFEMODINANDPHYSCIONINJUEMINGJIANGZHITABLETS

LVTao1,LIUMin2,JIAHaihong2,LANGShuhui2,FANShuyan2*
(1.LaboratoryCenter,theSchoolofPhamacy,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.DepartmentofPhamacuticalAnalysis,theSchoolofPhamacy,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveToestablishareversedphasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC)methodfordeterminationofemodinandphyscioninJuemingJiangzhiTablets.MethodsRP-HPLCsystemwascarriedoutonKromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)columnwithamobilephase,thestandardsandsampleswereseparatedusingagradientmobilephaseconsistingofmethanol,tetrahydrofuranand1%phosphoricacid(84∶7∶9).Thecolumntemperaturewas25℃andtheflowratewas1.0mL/min.Thenuciferinewasdetectedatthewavelengthof254nm.Theinjectionvolumewas20μL.ResultsEmodinandphyscionwereseparatedfromimpuritieswellanditsretentiontimewasatabout6.9min,11.8min.RegressequationwasY=3.31×104X-4.63×103(R=0.999 7).Thelinearintherangeofemodinwas3.12-9.36mg/L.Theaveragerecoverywas102.1%,anditsRSDratewas1.7% (n=9);RegressequationwasY=2.35×104X+8.80×103(R=0.999 8).Thelinearintherangeofphyscionwas2.1-10.5mg/L.Theaveragerecoverywas104.7%,anditsRSDratewas1.3%(n=9).ConclusionRP-HPLCisareliableandaccuratemethod,whichcanbeappliedfordeterminationofemodinandphyscioninJuemingJiangzhiTablets.

chromatography,highperformanceliquid；JuemingJiangzhiTablets；emodin；physcion

2013-12-23；

2014-01-14

律濤(1985-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，從事藥物化學(xué)和藥物分析研究。

*通訊作者。E-mail：fanshuyan_ykd@163.com

R446.1；R975.3

A

1007-3205(2014)08-0908-03