丹參酮ⅡA保護(hù)腦梗死大鼠血腦屏障的機(jī)制研究

溫 雅，祝春華，王力娜，季 輝，劉 瑩(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

·論著·

丹參酮ⅡA保護(hù)腦梗死大鼠血腦屏障的機(jī)制研究

溫 雅，祝春華，王力娜，季 輝，劉 瑩
(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

目的探討丹參酮ⅡA對大鼠腦梗死后血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型。實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)分組(n=168)，分為假手術(shù)組、MCAO組、丹參酮ⅡA大劑量組、丹參酮ⅡA小劑量組。丹參酮ⅡA于術(shù)后立即腹腔注射，大鼠24h處死。采用Western Blot和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定claudin-5蛋白和IgG變化，激光共聚焦顯微鏡觀察雙重?zé)晒鈽?biāo)記的claudin-5和IgG在腦組織的分布，并觀察神經(jīng)功能、腦梗死體積和腦水腫。結(jié)果與假手術(shù)組比較，MCAO組claudin-5表達(dá)明顯減少；大劑量丹參酮ⅡA能夠顯著上調(diào)claudin-5，明顯改善神經(jīng)功能，減輕腦水腫，減小梗死體積，減少IgG滲出，保護(hù)血腦屏障。結(jié)論大劑量丹參酮ⅡA通過上調(diào)claudin-5表達(dá)，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的完整性，對血腦屏障發(fā)揮保護(hù)作用，是丹參酮ⅡA治療腦梗死的重要機(jī)制

腦梗死；血腦屏障；丹參酮

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.001

血腦屏障破壞是腦梗死后腦水腫形成的主要原因，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要機(jī)制之一[1]，而決定血腦屏障完整性的最主要結(jié)構(gòu)是緊密連接蛋白。Claudin-5是緊密連接蛋白的代表成分，其水平代表了血腦屏障的完整性。增加claudin-5表達(dá)的藥物能夠有效保護(hù)血腦屏障完整性，減輕腦水腫[1-2]。丹參酮ⅡA是中藥丹參的有效活性成分[3]，能夠抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，廣泛用于治療心腦血管病等[4]。而丹參酮Ⅱ能否保護(hù)血腦屏障以及詳細(xì)機(jī)制有待明確。本研究建立大鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，觀察丹參酮ⅡA對腦梗死后腦水腫和claudin-5表達(dá)的影響，探討其對血腦屏障的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性健康清潔級(jí)SD大鼠168只，體質(zhì)量250～280g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑和儀器：兔抗claudin-5多克隆抗體(美國SantaCraz)；DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠)；Synergy-HT多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)；聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀(德國Eppendorf)；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀7500(美國ABI)；OLYMPUSFV10-ASW激光掃描共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成：上海生物工程公司合成，引物序列如下。Claudin-5，上游5′-CACAGAGAGG-GGTCGTTGAT-3′，下游5′-ACTGTTAGCGGCAGTTT-GGT-3′；β-actin，上游5'-GCCATGTACGTAGCCAT-CCA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型：線栓法建立持續(xù)性大鼠右側(cè)MCAO模型。隨機(jī)將168只SD大鼠分為假手術(shù)組、MCAO組、丹參酮ⅡA大劑量(丹參酮ⅡA-H)組、丹參酮ⅡA小劑量(丹參酮ⅡA-L)組，每組42只。假手術(shù)組血管分離后不插線栓。丹參酮ⅡA組分別以20mg/kg和10mg/kg于MCAO手術(shù)后立即腹腔注射。

1.2.2 神經(jīng)功能缺失評(píng)分：處死之前，單盲采用改良的Longa分級(jí)法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。0分，無缺陷；1分，不能伸展對側(cè)前肢；2分，對側(cè)前肢屈曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，向?qū)?cè)跌倒(n=10)。

1.2.3 腦組織含水量測定：大鼠在手術(shù)后24h斷頭，迅速取腦。冠狀切開去除額極，雙側(cè)取約2mm厚的腦組織，采用干濕法測定腦組織含水量，腦組織含水平=(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%(n=8)。

1.2.4 腦梗死體積測定；各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間斷頭取腦，均勻切成5片冠狀切片，浸入2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，37℃染色30min后4%多聚甲醛中固定24h。梗死體積百分比=(矯正梗死體積/非缺血側(cè)半球體積)×100%(n=6)。

1.2.5Claudin-5表達(dá)和IgG熒光滲出：采用WesternBlot檢測claudin-5蛋白表達(dá)(n=6)，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測claudin-5mRNA表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參基因(n=6)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察冰凍腦組織片內(nèi)claudin-5及IgG的共表達(dá)并同時(shí)測定滲出IgG的強(qiáng)度(n=6)。

2 結(jié) 果

2.1 丹參酮ⅡA改善大鼠MCAO后的神經(jīng)功能：MCAO組、丹參酮ⅡA-H組、丹參酮ⅡA-L組與假手術(shù)組比較，均有明顯的神經(jīng)功能障礙。與MCAO組相比，TanⅡA-H組的神經(jīng)功能在24h得到明顯改善(P<0.05)。TanⅡA-L組的神經(jīng)功能評(píng)分雖然低于MCAO組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24h神經(jīng)功能評(píng)分(n=10)

*P<0.05與其他組比較(單因素方差分析)

Figure1Theneurologicaldeficitsat24hafteroperation(n=10)

*P<0.05vsothergroupsbyANOVA

2.2TanⅡA顯著減輕患側(cè)腦水腫：術(shù)后24h，與假手術(shù)組比較，其余3組患側(cè)腦組織有明顯的水腫(P<0.05)；與MCAO組相比，TanⅡA-H組患側(cè)腦水腫得到明顯改善(P<0.05)，TanⅡA-L組患側(cè)腦水腫改善差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

GroupsWatercontentofipsilateralhemisphereSham?operated77．87±0．17MCAO83．21±0．12?TanⅡA?L81．75±0．06?TanⅡA?H78．60±0．05?# F1．012 P<0．05

*P< 0.05vssham-operated group #P<0.05vsMCAO group byqtest

2.3 TanⅡA顯著減小腦梗死體積：假手術(shù)組未見缺血病灶，MCAO組、TanⅡA-L組和TanⅡA-H組均有大小不等的缺血性病灶。TanⅡA-H組與MCAO組比較，缺血性病灶體積明顯減小(P<0.05)。見表2。

GroupsInfarctvolumeMCAO51．00±0．75TanⅡA?L47．54±3．96TanⅡA?H28．57±1．07? F2．375 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

2.4 TanⅡA上調(diào)claudin-5表達(dá)：與假手術(shù)組比較，MCAO組腦缺血后24h時(shí)claudin-5蛋白表達(dá)水平明顯下降；與MCAO組比較，TanⅡA-L和TanⅡA-H均能夠顯著上調(diào)claudin-5表達(dá)(P<0.05)。見表3。

GroupsClaudin?5proteinClaudin?5mRNASham?operated0．26±0．071．12±0．11MCAO0．13±0．010．60±0．13TanⅡA?L0．31±0．05?1．39±0．28?TanⅡA?H0．31±0．72?1．44±0．32? F2．1052．331 P<0．05<0．05

*P< 0.05vsMCAO group byqtest

2.5 TanⅡA減少IgG熒光滲出：與MCAO組比較，TanⅡA-H能夠顯著減少IgG的滲出，而TanⅡA-L作用不明顯。見表4。

GroupsImmunofluorescentintensityofIgGMCAO1811．16±185．25TanⅡA?L1607．52±177．40TanⅡA?H1168．72±160．04? F2．874 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

3 討 論

血腦屏障結(jié)構(gòu)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和緊密連接蛋白、基底膜以及血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足。緊密連接蛋白的作用是連接血管內(nèi)皮細(xì)胞，是決定血腦屏障的完整性的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)[1-3]。其中，claudin-5是最重要的貫穿緊密連接蛋白中的特殊蛋白，大量分布于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞[3-4]。

血腦屏障的完整性是保證腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要基礎(chǔ)[5]。研究[4，6]證明，腦梗死后早期就引起血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞，使其通透性增加，是各種炎癥介質(zhì)、抗體、補(bǔ)體以及血漿蛋白等進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，引起腦水腫等一系列病理反應(yīng)的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦梗死后24h時(shí)，出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能障礙和腦水腫，血腦屏障完整性破壞，claudin-5表達(dá)明顯減少。有研究[1]證明，claudin-5基因敲除后，相對分子質(zhì)量小于800 000的物質(zhì)能夠順利通過血腦屏障進(jìn)入腦組織。而促進(jìn)claudin-5表達(dá)的藥物能夠有效降低血腦屏障通透性[7-8]。

丹參酮ⅡA是從唇形科植物丹參的根中提取分離的二萜醌類化合物,為丹參中的有效成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA不僅具有較強(qiáng)的抗菌、抗炎、抗腫瘤活性，還具有抗血小板聚集、抗血栓作用[9]。在腦梗死方面，研究證明丹參酮ⅡA分別通過抑制腦梗死后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等途徑，能夠有效減小腦梗死體積，減輕腦水腫，具有神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大劑量丹參酮ⅡA(20mg/kg)能夠顯著上調(diào)claudin-5蛋白和基因表達(dá)，減少大分子物質(zhì)IgG滲出，減小腦梗死體積，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能。

綜上所述，丹參酮ⅡA通過上調(diào)claudin-5水平，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的完整性，降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫，是其治療腦梗死的部分作用機(jī)制。但是，丹參酮ⅡA治療腦梗死以及保護(hù)血腦屏障的詳細(xì)機(jī)制仍需深入研究。

[1] GIBSON CL,SRIVASTAVA K,SPRIGG N,et al.Inhibition of Rho-kinase protects cerebral barrier from ischaemia-evoked injury through modulations of endothelial cell oxidative stress and tight junctions[J].J Neurochem，2014，129(5):816-826.

[2] JIA W,LU R,MARTIN TA,et al.The role of claudin-5 in blood-brain barrier (BBB) and brain metastases (review)[J].Mol Med Rep，2014，9(3):779-785.

[3] NITTA T,HATA M,GOTOH S,et al.Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice[J].J Cell Biol,2003,161(3):653-660.

[4] JIAO H,WANG Z,LIU Y,et al.Specific role of tight junction proteins claudin-5,occludin,and ZO-1 of the blood-brain barrier in a focal cerebral ischemic insult[J].J Mol Neurosci,2011,44(2):130-139.

[5] JIANG SI,JEONG SI,KIM KJ,et al.Tanshinone ⅡA from Salvia miltiorrhiza inhibits inducible nitric oxide synthase expression and production of TNF-alpha,IL-1beta and IL-6 in activated RAW 264.7cells[J].Planta Med,2003,69(11):1057-1059.

[6] YANG Y,ROSENBERG GA.Blood-brain barrier breakdown in acute chronic cerebrovascular disease[J].Stroke,2011,42(11):3323-3328.

[7] MORITA K,SASAKI H,FURUSE M,et al.Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells[J].J Cell Biol,1999,147(1):185-194.

[8] CHEN Y,WU X,YU S,et al.Neuroprotective capabilities of Tanshinone ⅡA against cerebral ischemia/reperfusion injury via anti-apoptotic pathway in rats[J].Biol Pharm Bull,2012,35(2):164-170.

[9] ZHOU L,ZUO Z,CHOW MS.Danshen: an overview of its chemistry,pharmacology,pharmacokinetics,and clinical use[J].J Clin Pharmacol,2005,45(12)：1345-1359.

[10] HONDA M,NAKAGAMA S,HAYASHI K,et al.Adrenomedullin improves the blood-brain barrier function through the expression of claudin-5[J].Cell Mol Neurobiol,2006,26(2):109-118.

[11] CHEN Y,WU X,YU S,et al.Neuroprotection of tanshinone ⅡA against cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibition of macrophage migration inhibitory factor in rats[J].PLoS One,2012,7(6):e40165.

[12] GIDDY JM,GASCHE YG,COPIN JC,et al.Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(2):H558-568.

(本文編輯：劉斯靜)

MECHANISMOFTANSHINONEⅡAPROTECTINGBLOOD-BRAINBARRIERINFOCALCEREBRALISCHEMIAOFRATS

WENYa,ZHUChunhua,WANGLina,JIHui,LIUYing
(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveThisstudyistoexploretheprotectiveroleandmechanismoftanshinoneⅡA(TanⅡA)fortheblood-brainbarrierinfocalcerebralischemiaofrats.MethodsMaleSprague-Dawleyratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).Sprague-Dawleyrats(n=168)wererandomlydividedintosham-operatedgroup,MCAOgroup,TanⅡAhigherdosegroup(TanⅡA-H)andTanⅡAlowerdosegroup(TanⅡA-L).TanⅡAwasadministeredwithintraperitomealinjectionimmediatelyafteroperation,ratswereexecutedat24h.WesternBlot,RT-PCRandconfocalmicroscopewereusedtomeasureclaudin-5proteinandIgGexpressioninischemicbrain.Andtheneurologicaldeficits,brainwatercontentandinfarctvolumewereexplored.ResultsAt24hafterfocalcerebralischemia,claudin-5expressioninMCAOgroupdecreased.Claudin-5inTanⅡA-Hgroupsignificantlyup-regulated,andalsoitsneurologicdeficit,infarctvolumeandbrainwatercontentwerealleviatedcomparedwithMCAOgroup(P<0.05).ConclusionTanⅡA-Hprotectedblood-brainbarrierpermeabilitybyincreasingclaudin-5,whichmightbethemechanismoftreatingfocalcerebralischemia.

braininfarction;blood-brainbarrier;tanshinone

2014-04-02；

2014-07-07

溫雅(1981-)，女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事腦血管疾病診治研究。

R743.33

A

1007-3205(2014)08-0869-04