丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及皮層基質金屬蛋白酶9、咬合蛋白表達的影響

孫東良，王麗娜，劉永亮，王麗娟，王 鵬(.河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經外科，河北 唐山 0600；.河北省唐山市人民醫(yī)院神經外科，河北 唐山 06000；.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 06000)

·論著·

丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及皮層基質金屬蛋白酶9、咬合蛋白表達的影響

孫東良1，王麗娜2，劉永亮2，王麗娟3，王 鵬2
(1.河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經外科，河北 唐山 063200；2.河北省唐山市人民醫(yī)院神經外科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠模型腦水腫及皮層基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表達的影響。方法Sprague-Dawley 雄性大鼠140只，隨機分為對照組和丁苯酞組(40mg/kg，1次/d)各70只。應用Marmarou法建立彌漫性腦損傷大鼠模型。2組分別于術后6、12、24、72、144h采用干濕質量法檢測大鼠腦組織含水量變化，采用免疫組織化學檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達變化。2組分別于術后6、24、72、144h采用Western blot法檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白含量變化。結果與對照組比較，丁苯酞組腦組織含水量降低，損傷區(qū)周圍皮層MMP-9表達減少(P<0.05)，咬合蛋白表達增多(P<0.05)。結論丁苯酞可降低彌漫性腦損傷大鼠皮層MMP-9的表達，增加咬合蛋白的表達，減輕腦水腫的形成。

腦損傷；腦水腫；基質金屬蛋白酶9；丁苯酞

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.004

丁苯酞是我國自行研制的一類治療缺血性腦血管病的新藥，對急性腦梗死有明顯的治療作用[1]。為弄清丁苯酞的作用機制，本研究觀察了丁苯酞對顱腦損傷大鼠腦水腫及損傷區(qū)周圍皮層基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表達的影響，旨在為丁苯酞在顱腦損傷中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物分組：健康Sprague-Dawley雄性大鼠140只，清潔級,體質量280～320g，由河北聯(lián)合大學實驗動物中心提供。按照隨機數(shù)字表法分為對照組和丁苯酞組各70只。分別于6、12、24、72 、144h行腦組織含水量測定和免疫組織化學檢測，每個時間點5只，腦組織含水量每組25只，免疫組織化學每組25只。2組再分別于6、24、72、144h行Westernblot檢測，每個時間點5只，Westernblot每組20只。

1.2 模型制備和給藥方法：參考Marmarou法[2]制作大鼠彌漫性腦損傷模型。乙醚麻醉動物(麻醉時間為70～150s)，將麻醉好的大鼠俯臥位固定于海綿床墊(10cm×20cm×30cm)上，將質量450g、直徑18mm的銅棒自1.5m高度垂直落下撞擊置于大鼠冠狀縫與失狀縫正中的不銹鋼墊，造成大鼠彌漫性顱腦損傷。丁苯酞組大鼠從致傷后30min起給予丁苯酞軟膠囊植物油溶液，藥物劑量按40mg/kg灌胃，1次/d，直至各時間點處死。對照組給予等量植物油。

1.3 腦組織含水量測定：隨機選取2組各時間點大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從損傷區(qū)周圍取200mg腦組織，應用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕質量并記錄后置于105℃恒溫干燥箱內干燥48h至恒質量，分析比較2組大鼠腦組織含水量變化。腦含水量稱干質量后按Elliot公式計算，腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.4 免疫組織化學染色：隨機選取2組各時間點大鼠各5只，深度麻醉后開胸,4%多聚甲醛灌注,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱過夜至組織塊沉底。冠狀切取2mm厚包含損傷區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定4h。經常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊取出放入切片機中做連續(xù)切片,片厚5μm。取各大鼠等部位切片3張，經二甲苯二級脫蠟各5min，梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫10min，以消除內源性過氧化物酶，高壓熱修復，后分別滴加1∶100比例稀釋的抗MMP-9一抗和1∶200比例稀釋的抗咬合蛋白一抗，4℃過夜，次晨取出置常溫，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，水沖洗后蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，包漿黃染。在200倍顯微鏡下在傷灶周圍隨機選取5個視野，用美國MediaCybernetics公司生產的Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)照相后計算每個視野中陽性細胞數(shù)目。

1.5Westernblot法：用細胞裂解液提取2組各時間點大鼠損傷區(qū)周圍腦組織總蛋白，運用考馬·斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100μg蛋白。進行15%SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶500稀釋)，山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶500稀釋)，山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)進行雜交。EcL發(fā)光劑3min，曝光，顯影，定影。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對Westemblot結果進行定量分析。

2 結 果

2.1 腦組織含水量：對照組和丁苯酞組腦損傷后腦組織中含水量逐漸增加，24h達到高峰，72h緩慢下降，144h基本達到6h水平(P<0.05)。與對照組相比，丁苯酞組大鼠腦組織含水量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

GroupsCorticalwatercontent(%)6h12h24h72h144hFPControl74．16±0．23 75．55±0．24?79．30±0．27?#78．05±0．25?#△73．10±0．18#△☆33．8320．000Butylphthalide73．63±0．26?74．78±0．25?77．54±0．27?#76．23±0．26?#△72．38±0．25#△☆317．1880．000 t3．4034．91910．46711．4285．254 P0．0090．0010．0000．0000．001

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.2 MMP-9免疫組織化學結果：腦損傷后對照組和丁苯酞組MMP-9陽性細胞(被染成棕黃色)數(shù)均隨時間延長逐漸增加，24h達到高峰，72h開始減少，144h基本達到6h水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點MMP-9陽性細胞數(shù)均較對照組明顯減少(P<0.05或<0.01)。見表2。

GroupsMMP?9(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl28．60±2．7055．40±3．21?111．80±2．95?#75．80±2．86?#△27．40±3．21#△☆697．9020．000Butylphthalide23．00±2．9241．80±2．59?86．20±1．92?#48．00±4．58?#△22．00±2．55#△☆367．2520．000 t3．1507．37616．25611．5042．946 P0．0140．0000．0000．0000．019

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.3 咬合蛋白免疫組織化學結果:腦損傷后對照組和丁苯酞組咬合蛋白陽性細胞(被染成棕黃色)數(shù)隨時間延長逐漸減少，24h減到最低，72h開始增加，144h基本達到6h水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點咬合蛋白陽性細胞數(shù)均較對照組明顯增多(P<0.05或<0.01)。見表3。

GroupsOccludin(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl29．80±0．4517．20±2．59?10．00±2．65?#15．60±1．14?△30．80±2．95#△☆88．2760．000Butylphthalide32．40±1．5226．40±1．14?18．60±1．82?#25．60±0．55?△33．60±0．89#△☆113．3500．000 t3．6777．2735．99217．6782．031 P0．0160．0010．0000．0000．047

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.4 MMP-9 Western bolt結果: 腦損傷后對照組和丁苯酞組MMP-9蛋白表達均隨時間延長逐漸增加，24h達到高峰，72h后開始減少(P<0.05)。丁苯酞組每個時點MMP-9蛋白表達均較對照組明顯減少(P<0.01)。見表4、圖1。

GroupsMMP?9(%)6h12h24h72h144hFPControl28．97±1．08 77．52±0．60?65．37±0．47?#34．59±0．54?#△5423．7010．000Butylphthalide24．36±0．8654．53±0．68?39．23±0．80?#26．85±1．29?#△1093．4800．000t7．46256．75363．16312．386P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

2.5 咬合蛋白Western bolt結果:腦損傷后對照組和丁苯酞組咬合蛋白表達隨時間延長逐漸減少，24h減到最低，72h開始增加，144h達到最高水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點咬合蛋白表達均較對照組明顯增多(P<0.01)。見表5、圖1。

GroupsOccludin(%)6h24h72h144hFPControl186．87±0．71146．26±0．81?164．50±0．61?#197．03±0．61?#△5458．9310．000Butylphthalide204．41±0．82168．54±0．81?190．76±0．50?#211．30±1．12?#△2518．0880．000 t36．04643．71274．60325．080 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

圖1 Western bolt檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達

1.對照組6h；2.對照組24h；3.對照組72h；4.對照組144h；.5.丁苯酞組6h；6.丁苯酞組24h；7.丁苯酞組72h；8.丁苯酞組144h

Figure 1 MMP-9 and occludin Western blot results

1.Control group 6h；2.Control group 24h；3.Control group 72h；4.Control group 144h；5.Butylphthalide group 6h；6.Butylphthalide group 24h；7.Butylphthalide group 72h；8.Butylphthalide group 144h

3 討 論

丁苯酞是一類治療急性缺血性腦血管病的新藥。既往研究[3-5]表明，丁苯酞具有改善腦微循環(huán)，增加腦血流量，抑制炎癥反應，保護線粒體，改善腦組織能量代謝，減輕自由基損傷，抑制氧化應激，保護血腦屏障，抑制神經細胞凋亡等作用。提示丁苯酞可減輕腦水腫的形成。而顱腦損傷后腦水腫的形成，是引起腦損傷后繼發(fā)死亡的主要原因。本研究結果示，腦損傷后6h腦水腫即開始形成，24h達高峰，72h開始緩解，144h腦水腫明顯緩解；而丁苯酞組腦組織含水量較對照組明顯減少。提示丁苯酞對腦損傷后腦水腫有明顯的治療作用。

MMP是一種鋅離子依賴性蛋白酶，主要參與調解細胞外的基質成分，臨床上主要參與動脈粥樣硬化、腫瘤轉移、炎癥反應等病理過程[6]。其中MMP-9主要存在于腦組織中，與腦血管病的關系最為密切。MMP-9可通過攻擊腦血管外基膜的主要成分層黏蛋白和纖黏蛋白，破壞血腦屏障，導致血腦屏障通透性增高，從而加重腦水腫的形成。而本研究表明腦損傷發(fā)生后MMP-9表達明顯增加，丁苯酞組MMP-9表達明顯減少。提示丁苯酞可減少MMP-9的表達。Gidday等[7]發(fā)現(xiàn)白細胞，特別是中性粒細胞是腦組織中MMP-9的主要來源，而MMP-9能促進白細胞的募集，造成繼微血管基底膜層黏蛋白水解后血腦屏障通透性的破壞，最終導致神經元的損傷。當顱腦損傷發(fā)生后繼發(fā)炎性反應，導致中性粒細胞數(shù)目增多，MMP-9生成增多。而丁苯酞具有抑制炎癥反應的作用。炎性細胞因子和C反應蛋白參與急性腦梗死的病理過程[8]。朱海生等[9]研究表明，丁苯酞具有抑制慢性腦供血不足患者血清C反應蛋白表達的作用。推測丁苯酞可能是通過抑制炎癥反應來減少MMP-9表達的。

咬合蛋白是血管內皮緊密連接的主要組成部分。郭平等[10]認為咬合蛋白的磷酸化狀態(tài)與緊密連接功能的維持密切相關。當咬合蛋白破壞時，緊密連接屏障功能受損，血腦屏障通透性增高，腦水腫形成。本研究結果表明，腦損傷發(fā)生后，損傷區(qū)周圍皮層咬合蛋白含量明顯下降，而丁苯酞可提高咬合蛋白的表達。MMP-9的表達與咬合蛋白的表達趨勢正好相反，我們認為顱腦損傷后通過炎癥反應激活了MMP-9，進而降解了血管內皮緊密連接中的咬合蛋白，從而導致了腦水腫的形成。而丁苯酞具有抑制炎癥反應的作用，可減少MMP-9的激活，從而減少咬合蛋白的破壞。此外，Seth等[11]研究發(fā)現(xiàn)，細胞內鈣離子濃度的升高，也可導致咬合蛋白發(fā)生磷酸化。腦損傷發(fā)生后引起的應激反應及缺血缺氧均可引起細胞內鈣離子濃度升高，從而使咬合蛋白磷酸化，緊密連接屏障功能受損。而鄢學芬等[12]研究表明，丁苯酞可降低神經細胞內鈣離子濃度的升高。我們認為丁苯酞可能通過改善腦微循環(huán)，保護線粒體，改善缺血區(qū)的能力代謝，降低細胞內的鈣離子濃度，從而減輕咬合蛋白的磷酸化。

綜上所述，丁苯酞可減輕彌漫性腦損傷大鼠腦水腫的形成，對腦損傷有一定的治療作用。丁苯酞可能是通過減少梗死灶周圍MMP-9的表達，減輕MMP-9對腦血管緊密連接中咬合蛋白降解，減輕血腦屏障的破壞，從而減輕腦水腫的形成。

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTOFBUTYLPHTHALIDEONBRAINEDEMAOFRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTIONANDEXPRESSIONOFCORTICALMATRIXMETALLOPROTEINASE-9ANDOCCLUDIN

SUNDongliang1,WANGLina2,LIUYongliang2,WANGLijuan3,WANGPeng2
(1.DepartmentofNeurosurgery,CaofeidianHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;>2.DepartmentofNeurosurgery,thePeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;3.DepartmentofLaboratory,FengrunSecondPeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China)

CT:ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthebrainedemaofratsfollowingtraumaticbraininjuryandtheexpressionofcorticalmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andoccludinaroundtheinjuryarea.MethodsOnehundredandfortySprague-Dawleymaleratsweredividedintocontrolgroupandbutylphthalidegroup(40mg/kg，onceaday).ThemodelwasmadebyMarmaroumethod.Afterinjury6h,12h,24h,72hand144h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternblotwereusedtoobservetheexpressionofMMP-9andoccludinaroundtheinjuryarea.ResultsComparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofMMP-9aroundtheinjuryareadecreasedsignificantly(P<0.05).Andthecontentofoccludinaroundtheinjuryareaincreased(P<0.05).ConclusionButylphthalidecouldreducetheexpressionofMMP-9followingtraumaticbraininjury,increasetheexpressionofMMP-9,andreducethebrainedema.

braininjuries;brainedema;matrixmetalloproteinase9;butylphthalide

2013-11-18；

2014-02-14

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(20130384)

孫東良(1972-)，男，河北唐山人，河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事神經外科疾病診治研究。

R651.15

A

1007-3205(2014)07-0756-05