應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)EphA2及其調(diào)節(jié)基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

石棟梁，杜 濤，習(xí)國平(.河北省邯鄲市第三醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，河北 邯鄲 05600;.河北省邯鄲市第二醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，河北 邯鄲 05600)

·論著·

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)EphA2及其調(diào)節(jié)基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

石棟梁1，杜 濤2，習(xí)國平1
(1.河北省邯鄲市第三醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，河北 邯鄲 056001;2.河北省邯鄲市第二醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，河北 邯鄲 056001)

目的探討同源異形盒基因A1(homeobox genes A1,HoxA1)、癌基因(cancer-myc,C-myc)、促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2,EphA2)與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從分子生物學(xué)角度探討喉癌的發(fā)病機(jī)制。方法40例喉癌組織及40例癌旁組織，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對(duì)照。所有腫瘤經(jīng)病理檢查證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織和正常組織取材經(jīng)病理檢查證實(shí)為炎癥或正常。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)喉癌組織、癌旁組織及喉部正常黏膜組織中EphA2、HoxA1、C-myc陽性表達(dá)率。結(jié)果EphA2、HoxA1、C-myc在喉癌組織中的陽性表達(dá)率分別高于癌旁組織和正常喉黏膜組織，而癌旁組織與正常喉黏膜組織間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌中的表達(dá)與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

喉腫瘤；基因表達(dá)；免疫組織化學(xué)

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.009

喉癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌調(diào)節(jié)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變有關(guān)，其中促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2(erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2,EphA2)與癌細(xì)胞增殖、發(fā)展有關(guān)。同源異形盒基因A1(homeoboxgenesA1,HoxA1)作為細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)基因,不僅調(diào)控胚胎細(xì)胞的增殖和分化,而且也是成人組織細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)基因；若HoxA1發(fā)生異常表達(dá),就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu),并可致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。癌基因(Cancer-myc,C-myc)屬于核蛋白類調(diào)控基因,其在細(xì)胞周期變化、細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、基因的不穩(wěn)定性、刺激血管生成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、分化及凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。EphA2的表達(dá)受到許多基因的調(diào)控。本研究從分子水平探討HoxA1、C-myc、EphA2與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2006年8月—2013年8月河北省邯鄲市第三醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的喉癌組織40例及相應(yīng)癌旁組織40例，非喉癌患者的喉部正常黏膜組織15例做對(duì)照。喉癌患者中男性37例，女性3例；年齡40～72歲，中位年齡56歲；所有腫瘤經(jīng)病理檢查證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例，其中T1N0M0 6例，T2N0M0 10例，T2N1M0 2例，T2N2M0 1例，T3N0M0 9例，T3N1M0 2例，T3N2M0 6例，T4N0M0 3例，T4N2M0 1例。癌旁組織和正常黏膜組織取材經(jīng)病理檢查證實(shí)為炎癥或正常。所有標(biāo)本取材后立即用液氮冷藏保存。正常黏膜患者中男性8例，女性7例，年齡32～56歲，中位年齡41歲，均為聲帶息肉病。

1.2 方法：石蠟標(biāo)本常規(guī)4μm連續(xù)切片，平鋪于載玻片上，放于60℃烤箱4h。浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10min。100%、90%、70%梯度酒精各5min，自來水沖洗，蒸餾水3min。3%H2O2及甲醇中室溫孵育15～20min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水3min×3次，0.01mol/LPBS5min?？乖迯?fù)，EphA2、HoxA1、C-myc采用枸櫞酸鹽緩沖液高壓鍋加熱2min進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫冷卻30min，放入PBS內(nèi)10min。吸去余液，擦凈載玻片。正常山羊或兔血清封閉，37℃濕盒內(nèi)孵育40min。傾去血清，滴加EphA2、HoxA1、C-myc一抗，濃度按1∶100稀釋，4℃過夜。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。滴加第2代生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃濕盒內(nèi)孵育25min。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃濕盒內(nèi)孵育25min。0.01mol/LPBS沖洗5min×3次。DAB液顯色。蘇木精復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定：EphA2和HoxA1判斷標(biāo)準(zhǔn)相同，陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)。光鏡(10×40倍)下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，采用雙評(píng)分，按陽性細(xì)胞百分率評(píng)分，<10%為0分，≥10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。然后按陽性分乘以染色分計(jì)總分，總分為0判為“-”，總分<3分判為“+”，3～6分判為“++”，>6分判為“+++”?！?”～“+++”為陽性表達(dá)。

C-myc陽性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。按染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率評(píng)分，<10%為0分，≥10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡值扔?為陰性，總分1～2為弱陽性，總分3～4為陽性，總分>4為強(qiáng)陽性。

癌組織染色強(qiáng)度≥3或癌組織雖然染色強(qiáng)度=2但陽性細(xì)胞百分率≥10%皆歸為有表達(dá)，癌組織染色強(qiáng)度≤1，不論陽性率多大，皆歸為無表達(dá)。

由3位獨(dú)立觀察者閱片，根據(jù)其評(píng)分的平均值確定判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

喉癌組織中EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白陽性表達(dá)率高于正常黏膜組織及癌旁組織(P<0.05)，而癌旁組織與正常黏膜組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 EphA2、Hoxa1和c-myc在癌組織及癌旁組織、正常黏膜組織中的表達(dá)Table 1 Expression of EphA2,HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma,para-carcinoma tissues and normal mucosa tissues (n，%)

*P<0.05vsnormal mucosa tissues #P<0.05vspara-carcinoma tissues by χ2test

3 討 論

Eph受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的分支，有對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。EphA2的過度表達(dá)具有轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞的能力，當(dāng)Eph-ephrin系統(tǒng)正常表達(dá)時(shí)可抑制細(xì)胞增生，異常表達(dá)時(shí)又可以促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Fujii等[1]將重組ephrinA1綁定到石川細(xì)胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不僅調(diào)控胚胎細(xì)胞的增殖和分化,而且也是成人組織細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)基因。若Hox基因發(fā)生異常表達(dá),就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu),并可致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是該基因的擴(kuò)增和過表達(dá),證明其在細(xì)胞周期變化、細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、基因的不穩(wěn)定性、刺激血管生成、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、分化及凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。腫瘤細(xì)胞為了生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須獲得血液供應(yīng)，通常認(rèn)為通過新生血管滿足其血液供應(yīng)。

細(xì)胞遷移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附與解離是其必要的步驟。多種Eph受體及配體在腫瘤中尤其是腫瘤生長(zhǎng)的高侵襲性階段有正調(diào)節(jié)作用。EphA2的過度表達(dá)不僅能導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而且能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞向外侵襲的能力，這是通過削弱腫瘤細(xì)胞之間的連接，增加腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附和增強(qiáng)在基質(zhì)的侵襲等方面實(shí)現(xiàn)的。任舒靈等[2]研究表明EphA2可降低鼻咽癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性。

Karidis等[3]研究發(fā)現(xiàn)EphA2與甲狀腺腫瘤生成有關(guān)。EphA2的表達(dá)增高與疾病分期及預(yù)后都有一定關(guān)系，因此，EphA2可以作為一個(gè)獨(dú)立的診斷指標(biāo)。Fujii等[4]采用印跡分析證實(shí)人類子宮內(nèi)膜EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等[5]研究表明EphA2在腫瘤新血管形成及侵襲轉(zhuǎn)移中起很重要的作用。Cheng等[6]研究表明，阻斷EphA2受體酪氨酸激酶可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管生成。靳文劍等[7]研究表明肝細(xì)胞癌組織中EphA2蛋白表達(dá)上調(diào),且其表達(dá)上調(diào)與肝癌的惡性病理特征及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān),提示EphA2蛋白可能在肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

HoxA1可控制細(xì)胞周期，通過結(jié)合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亞基發(fā)揮作用。這種結(jié)合啟動(dòng)G2停止期的非洲蟾蜍卵母細(xì)胞以及G2停止期、DNA受損的Jurket細(xì)胞(注：屬急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系)進(jìn)入M期。Kang等[8]研究表明HoxA1在胃癌細(xì)胞的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜上皮，成為胃癌DNA甲基化標(biāo)記物之一。Tsou等[9]研究表明HoxA1在肺腺癌細(xì)胞中的超甲基化水平遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞(P<0.01)。但HoxA1在喉癌中的表達(dá)未見報(bào)道。

本研究結(jié)果與應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究結(jié)論相似[10]。C-myc基因擴(kuò)增量與C-myc蛋白表達(dá)量無關(guān)，C-myc蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)陰性組中高于淋巴結(jié)陽性組可能是由于隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展其mRNA變得更加不穩(wěn)定所致。C-myc對(duì)EphA2的下調(diào)在乳腺上皮細(xì)胞中有效，而在癌細(xì)胞中EphA2對(duì)C-myc卻不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中的因果關(guān)系以及其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達(dá)情況，其可能參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，提示將來通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)可能在喉癌的臨床治療中有一定應(yīng)用價(jià)值。

盡管關(guān)于喉癌的此類研究較少，但是我們推測(cè)EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達(dá)變化與喉癌的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在喉癌組織中的表達(dá)情況可能預(yù)示癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達(dá)可能對(duì)判斷喉癌的惡性程度、病情進(jìn)展有重要價(jià)值。

總之，喉癌細(xì)胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促進(jìn)了喉癌的發(fā)生發(fā)展，為喉癌的診斷和治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。因此，深入研究EphA2和HoxA1、C-myc的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制，進(jìn)而選擇最佳靶位，可能為封閉、阻斷喉癌的發(fā)生發(fā)展提供更有力的依據(jù)。

[1] FUJII H,FUJIWARA H,HORIE A,et al.EphrinA1 stimulates cell attachment and inhibits cell aggregation through the EphA receptor pathway in human endometrial carcinoma-derived Ishikawa cells[J].Hum Reprod,2011，26(5):1163-1170.

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[10] 石棟梁,杜濤,習(xí)國平.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EphA2及其調(diào)節(jié)基因HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(3):294-297.

(本文編輯：趙麗潔)

EXPRESSIONANDRELATIONSOFEphA2,HoxA1ANDC-mycINLARYNGEALCARCINOMAWITHIMMUNOHISTOCHEMICALSTAINING

SHIDongliang1,DUTao2,XIGuoping1
(1.DepartmentofOtolaryngology,theThirdHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China;2.EndoscopyRoom,theSecondHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China)

ObjectiveThestudyexploredtherelationofhomeoboxgenesA1(HoxA1),cancer-myc(C-myc)anderythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2(EphA2)withlaryngealcarcinomaforthegenesismechanismoflaryngealcarcinomaatthelevelofmolecularbiology.MethodsFortylaryngealcarcinomafreshsampleswereanalyzedandmeanwhile40para-carcinomatissuesand15normallaryngealmucosasampleswerealsostudiedascontrols.Alltumortissueswereconfirmedtobesquamous-cellcarcinoma;thepara-carcinomatissuesandnormalmucosawereconfirmedtobeinflammatoryornormalmucosapathologically.TheexpressionofEphA2,HoxA1andC-mycproteinweremeasuredinlaryngealcarcinoma,para-carcinomatissuesandnormallarynnealmucosatissueswiththeimmunohistochemicalstaining.ResultsTheexpressionsofEphA2,HoxA1,C-mycinlaryngealcarcinomatissuesweresignificantlyhigherthanthoseofpara-carcinomaandinnormallaryngealmucosatissues,respectively.Therewasnosignificantdifferencebetweentheexpressionsofpara-carcinomaandnormallaryngealmucosatissues.ConclusionTheexpressionsofEphA2,HoxA1andC-myccontributetothecarcinogenesisanddevelopmentoflaryngealcarcinoma.

laryngealneoplasms；geneexpression；immunohistochemistry

2013-10-15；

2014-02-12

石棟梁(1971-)，男，河北魏縣人,河北省邯鄲市第三醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事耳鼻咽喉頭頸外科疾病診治研究。

R739.65

A

1007-3205(2014)09-1018-04