腎盂輸尿管連接部梗阻段Cajal間質(zhì)細(xì)胞和CX43表達(dá)的檢測(cè)

李 浩，范應(yīng)中#，孫生安，李瀘平，張勝利，王文舉, 杜昆峰

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052 2)洛陽(yáng)市中心醫(yī)院普外科 洛陽(yáng) 471000

腎盂輸尿管連接部梗阻段Cajal間質(zhì)細(xì)胞和CX43表達(dá)的檢測(cè)

李 浩1)，范應(yīng)中1)#，孫生安2)，李瀘平1)，張勝利1)，王文舉1), 杜昆峰1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052 2)洛陽(yáng)市中心醫(yī)院普外科 洛陽(yáng) 471000

#通訊作者，男，1965年3月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：尿道組織工程，E-mail：fanyingzhong2@163.com

先天性腎積水；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；CX43；C-kit

先天性腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)是小兒泌尿外科最常見(jiàn)的先天畸形之一[1]，其所致腎積水的發(fā)病率為1/800～1/600[2]。有研究[2]提示UPJO的病因可能與Cajal間質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是1893年由神經(jīng)解剖學(xué)家Santiago Ramon Y Cajal在胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)并以其名字命名的，它是存在于胃腸道自主神經(jīng)末梢和平滑肌之間的一種特殊間質(zhì)細(xì)胞，主要位于非膽堿非腎上腺素能神經(jīng)纖維末梢和平滑肌之間。該研究通過(guò)HE染色、C-kit和縫隙連接蛋白43(connexin 43,CX43)免疫組織化學(xué)染色，了解Cajal間質(zhì)細(xì)胞和CX43在腎盂輸尿管連接處的分布情況，探討它們?cè)谙忍煨阅I積水發(fā)病中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2011年7月至2013年6月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科住院、因先天性腎積水行單側(cè)腎盂成形術(shù)的患者的UPJO段組織樣本35例(病例組)；35例中男21例，女14例，年齡35 d～14歲[(4.5±4.0)歲]，左側(cè)18例，右側(cè)17例。所有患兒術(shù)前經(jīng)泌尿系彩超、靜脈腎盂造影或CT尿路造影、逆行膀胱造影等確診為UPJO引起的腎積水，術(shù)中均證實(shí)為腎盂輸尿管連接部狹窄。依據(jù)腎盂積水程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]分為輕度腎積水10例，中度腎積水11例，重度腎積水14例。取20例因腎臟腫瘤行腎切除患者的腎盂輸尿管連接處組織作對(duì)照，排除腎盂輸尿管連接處狹窄，組織學(xué)證實(shí)無(wú)侵犯；20例中男11例，女9例，年齡3個(gè)月～6歲[(3.3±1.7)歲]，左側(cè)8例，右側(cè)12例。

1.2 2種組織組織學(xué)觀察和CX43、C-kit蛋白的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)試劑：鼠抗人C-kit單克隆抗體(Sc-5655,美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗人CX43多克隆抗體(MY90198,上海翔升生物科技有限公司)，SP-9000免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒、聚賴(lài)氨酸(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，中性樹(shù)脂(上海標(biāo)本模型廠)。

標(biāo)本制備和檢測(cè)方法：將待檢標(biāo)本浸泡在體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中固定24 h以上，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后行連續(xù)性切片，厚度3～4 μm，之后將切片分別置于APES膠處理過(guò)的載玻片上，室溫干燥48 h后置入4 ℃冰箱內(nèi)保存，分別用于HE染色、C-kit與CX43免疫組化染色，染色步驟均按試劑盒說(shuō)明操作?？贵w按1100稀釋。C-kit結(jié)果判定：每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕色顆粒狀物質(zhì)者為C-kit陽(yáng)性細(xì)胞。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]：視野中未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)；偶爾可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞或判斷不明確為(+)；可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，但陽(yáng)性細(xì)胞百分比小于10%為()；陽(yáng)性細(xì)胞百分比大于10%者為()。、視為C-kit蛋白表達(dá)陽(yáng)性。CX43結(jié)果判定：每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，CX43免疫反應(yīng)物呈黃褐色顆粒狀，主要分布于相鄰兩細(xì)胞膜接觸處及其兩側(cè)的細(xì)胞漿內(nèi)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]：視野中看不到陽(yáng)性染色細(xì)胞區(qū)域的為(-)；可看到1處陽(yáng)性染色區(qū)域但未見(jiàn)明顯棕黃色顆粒狀物質(zhì)或者是判斷不清的為(+)；可看到2～3處陽(yáng)性染色區(qū)域或者可見(jiàn)明顯的棕黃色顆粒狀染色區(qū)域的為()；可看到多于4處陽(yáng)性染色區(qū)域或者看到棕黃色顆粒狀呈小團(tuán)塊狀的染色組織為()。、視為CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較2組C-kit和CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異，病例組C-kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與腎積水程度的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組C-kit及CX43表達(dá)的比較組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組標(biāo)本平滑肌內(nèi)縱外橫排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯纖維組織增生。病例組標(biāo)本可見(jiàn)輸尿管平滑肌肌層肥厚，排列紊亂，細(xì)胞胞漿嗜酸性減弱，細(xì)胞間質(zhì)纖維組織少量增生，同時(shí)黏膜層可見(jiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化染色結(jié)果顯示對(duì)照組標(biāo)本肌間可見(jiàn)較多C-kit陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，呈梭形或星形，細(xì)胞核大，核周胞質(zhì)較少；漿膜及黏膜層未見(jiàn)C-kit陽(yáng)性細(xì)胞。病例組標(biāo)本肌間未見(jiàn)或可見(jiàn)少量C-kit陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)照組標(biāo)本環(huán)形肌和縱形肌交界處可見(jiàn)CX43陽(yáng)性表達(dá)，部分沿血管壁分布，黏膜下層亦可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。病例組肌層偶見(jiàn)CX43陽(yáng)性表達(dá)，大部分標(biāo)本未見(jiàn)CX43的陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。2組C-kit和CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較見(jiàn)表1。

圖1 HE染色及免疫組化染色結(jié)果

A1：對(duì)照組輸尿管平滑肌排列規(guī)則(HE, ×200)；A2:病例組輸尿管肌層肥厚，排列紊亂(HE，×200)；B1：對(duì)照組輸尿管肌層可見(jiàn)較多C-kit陽(yáng)性細(xì)胞(SP，×400)；B2：病例組輸尿管肌層C-kit陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(SP，×400); C1:對(duì)照組輸尿管肌層分布較多CX43蛋白(SP，×400)；C2：病例組輸尿管肌層CX43蛋白分布明顯減少(SP，×400)。

表1 2組C-kit及CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 例(%)

2.2病例組C-kit蛋白的表達(dá)與腎積水程度的關(guān)系病例組C-kit蛋白的表達(dá)隨腎積水程度的加重呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 病例組C-kit蛋白的表達(dá)與腎積水程度的關(guān)系 例

rs=-0.486，P=0.003。

3 討論

近年來(lái)很多學(xué)者在輸尿管平滑肌運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)分布及支配方面做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，但仍未能完全揭示UPJO的病理機(jī)制。有研究[6-7]證實(shí)Cajal間質(zhì)細(xì)胞是慢波電位的起搏者和基本電節(jié)律的傳播者。先天性UPJO平滑肌肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞比正常組織減少[8]。相關(guān)研究[9]發(fā)現(xiàn)，Cajal間質(zhì)細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞之間可形成網(wǎng)絡(luò)和許多縫隙連接，在控制平滑肌的蠕動(dòng)和介導(dǎo)神經(jīng)信息傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。CX43作為人體中一種重要的縫隙連接蛋白，參與機(jī)體的許多病理生理過(guò)程，其分布或者表達(dá)異常與多種疾病有密切關(guān)系，如不穩(wěn)定性膀胱和膀胱輸尿管返流等[10]。

多項(xiàng)研究[11-12]顯示輸尿管組織內(nèi)存在多種類(lèi)型的神經(jīng)組織，而且這些神經(jīng)組織可能在輸尿管的蠕動(dòng)中起關(guān)鍵作用。作者通過(guò)C-kit標(biāo)記Cajal間質(zhì)細(xì)胞，免疫組化染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，病例組Cajal間質(zhì)細(xì)胞減少，CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低。UPJO中腎盂輸尿管連接處肌層間Cajal間質(zhì)細(xì)胞減少可使起搏細(xì)胞慢波電位的產(chǎn)生減少，該處的電活動(dòng)不能有效向下傳導(dǎo)，平滑肌的收縮節(jié)律不規(guī)整，從而引起輸尿管蠕動(dòng)減弱，尿液流出受阻，導(dǎo)致梗阻性腎積水。此外，該研究結(jié)果還顯示，隨著腎積水程度的加重，C-kit蛋白的表達(dá)呈減少趨勢(shì)，表明Cajal間質(zhì)細(xì)胞的減少可能與腎積水的病理進(jìn)程存在一定關(guān)系。

綜上所述，Cajal間質(zhì)細(xì)胞及CX43蛋白的表達(dá)減少可能在先天性梗阻性腎積水的發(fā)病中發(fā)揮較為重要的作用，但其表達(dá)減少是引起UPJO的始動(dòng)因素，還是梗阻之后出現(xiàn)的繼發(fā)性改變，尚有待于進(jìn)一步研究。

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(2013-06-21 收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.036