特發(fā)性弱精子癥患者精子中TCTE3的表達*

李玉山，吉曉菲，王全先，楊險峰，潘周輝，胡耀龍

鄭州大學第三附屬醫(yī)院人類精子庫 鄭州 450052

特發(fā)性弱精子癥患者精子中TCTE3的表達*

李玉山△，吉曉菲，王全先，楊險峰，潘周輝，胡耀龍

鄭州大學第三附屬醫(yī)院人類精子庫 鄭州 450052

△男，1966年1月生，碩士，教授，研究方向：生殖免疫學，E-mail：liyushanrun@126.com

T復合體相關睪丸表達3；特發(fā)性弱精子癥；軸絲動力蛋白

目的：探討T復合體相關睪丸表達3(TCTE3)與特發(fā)性弱精子癥發(fā)生的關系。方法采用RT-PCR和Western blot方法檢測正常成年男性(正常對照)和特發(fā)性弱精子癥患者各30例精子標本中TCTE3 mRNA和蛋白的表達。結(jié)果TCTE3 mRNA和蛋白在特發(fā)性弱精子癥組精子中的相對表達量均低于正常對照組(t=3.038和2.460，P=0.005和0.017)。結(jié)論TCTE3表達的降低可能在弱精子癥的發(fā)生中起著重要作用。

研究[1-2]顯示，目前全世界已婚夫婦中，不孕不育者約占15%，其中男性不育約占一半。無精子癥、弱精子癥、少精子癥和畸形精子癥是影響男性生育的常見原因，約占男性不育因素的90%[3],其中弱精子癥約占19%。為了明確特發(fā)性弱精子癥發(fā)病的相關因素，作者所在的課題組[4-6]前期進行了一系列弱精子癥發(fā)病關系的相關研究。近年研究發(fā)現(xiàn)的T復合體相關睪丸表達3(T-complex associated testis expressed 3，TCTE3)是精子鞭毛和纖毛中段軸絲動力蛋白輕鏈家族成員之一，編碼假定的動力蛋白輕鏈，表達于小鼠精子鞭毛中段軸絲外側(cè)雙聯(lián)微管。有學者[7]通過基因敲除技術發(fā)現(xiàn)TCTE3-/-雄性小鼠出現(xiàn)精子脆弱和前向運動能力降低并且運動不協(xié)調(diào)，由此推斷TCTE3表達缺失會導致雄性小鼠精子鞭毛能動性降低和弱精子癥的發(fā)生。目前國內(nèi)外尚缺少TCTE3在人類精子中表達的研究。作者采用RT-PCR和 Western blot方法檢測 TCTE3 mRNA和蛋白在正常男性和特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達情況，進一步為弱精子癥的發(fā)生及診斷研究提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器RNA提取試劑盒(北京康為世紀公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司產(chǎn)品)，PCR試劑盒(上海萊楓公司產(chǎn)品)，TCTE3引物(上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品)，細胞裂解液RIPA(碧云天生物技術研究所)，鼠抗人TCTE3抗體(臺灣Abnova公司)，兔抗鼠IgG(北京博奧森生物公司)；圖像掃描儀等為General Electronic公司產(chǎn)品。

1.2標本的篩選收集2012年7月至11月河南省人類精子庫合格供精志愿者和鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心不育門診弱精子癥患者的精液。嚴格按照WHO第5版的方法進行常規(guī)檢測，篩選精液量、液化時間、pH、精子形態(tài)、精漿果糖、酸性磷酸酶、α葡萄糖苷酶等參數(shù)均正常的標本。正常對照組30例，年齡22～35(27.0±2.4)歲，精子密度≥20×106mL-1，精子前向運動能力(PR)≥32%；特發(fā)性弱精子癥組30例，年齡21～38(30.4±3.0)歲，精子密度≥20×106mL-1，PR<32%。2組血清生殖激素檢查均正常，無支原體、衣原體感染，精漿抗精子抗體陰性。

1.3精液的處理待精液液化后，分別經(jīng)體積分數(shù)40%和80%的Percoll液非連續(xù)密度梯度離心(2 000 r/min，20 min)，棄去上層液體，收集底部精子，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌3次，調(diào)精子密度為50×106mL-1，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4精子中TCTE3mRNA的RT-PCR檢測取分離純化的精子，按照RNA提取試劑盒操作說明書提取RNA，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。每樣本均取等量總RNA 11 μL進行反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒操作說明合成cDNA。取cDNA 2 μL作為模板，在25 μL體系中進行PCR反應，以β-actin為內(nèi)參。用Premier 5.0軟件設計TCTE3引物序列,上游:5’-TCTGGGACATTG CATGGGAC-3’，下游:5’-AAGGGCAAACACCAAGAC CA-3’，產(chǎn)物大小為83 bp；β-actin引物序列，上游：5’-GAAGGTTATGCCCTGCCTCA-3’,下游:5’-ACATCTCGCACAATCTCCCG-3’,產(chǎn)物大小為137 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳20 min后，經(jīng)圖像掃描儀拍照掃描，最后用Image J軟件對圖像進行分析，以TCTE3與β-actin條帶灰度值的比值作為TCTE3 mRNA的相對表達量。

1.5精子中TCTE3蛋白的Westernblot檢測將1 mL細胞裂解液RIPA與純化精子相混合，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF(100 g/L)10 μL，混勻后冰上超聲裂解(功率200 W)5 s×5次,放置30 min，然后4 ℃ 12 000g離心15 min，BCA法檢測上清中總蛋白濃度。將蛋白樣品用100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離后，用20 V電壓將凝膠上蛋白半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上30 min，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，洗滌后與 1800稀釋的鼠抗人TCTE3抗體37 ℃孵育1 h，洗滌后再與12 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG室溫孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌10 min×3次,進行ECL化學發(fā)光處理。以β-actin作為內(nèi)參。然后用圖像掃描儀掃描， Image J軟件對圖像進行分析，以TCTE3與β-actin條帶灰度值的比值作為TCTE3蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0分析。2組精子中TCTE3 mRNA和蛋白表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組精子中TCTE3mRNA的表達見圖1、表1。

2.2 2組精子中TCTE3蛋白的表達見圖2、表1。

M：Marker；N1，N2，N3：正常對照組； A1，A2，A3：特發(fā)性弱精子癥組。

圖2 2組精子中TCTE3蛋白的表達

M:Marker;N1，N2：正常對照組；A1，A2，A3：特發(fā)性弱精子癥組。

表1 2組精子中TCTE3表達的比較

3 討論

不孕癥的診斷和治療已經(jīng)在臨床上廣泛開展，對弱精子癥的探討成為人們近來感興趣的課題。特發(fā)性弱精子癥是男性不育的重要原因之一，它顯著的伴隨特征為精子運動能力下降。精子運動缺陷的潛在分子機制在很大程度上仍不為人知。根據(jù)精子超微結(jié)構(gòu)，精子鞭毛的異常在一定程度上會影響精子的活動和功能，包括線粒體異常、外周致密纖維異常、軸絲畸形等，尤其是軸絲中周圍微管支臂的異常。微管的動力蛋白臂結(jié)構(gòu)、排列方式、表達量等是精子正常運動的基本保證。蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)了200多種鞭毛蛋白，其突變可能會導致一些疾病的發(fā)生。TCTE3基因編碼精子鞭毛和纖毛中段軸絲動力蛋白輕鏈，TCTE3蛋白與其他動力蛋白輕鏈有高度的相似性[8]。研究[9]結(jié)果表明，TCTE3首先在小鼠的睪丸中鑒定，細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)其定位于精子鞭毛整個長度，常作為非孟德爾遺傳定律研究的候選基因，也是引發(fā)細胞程序性死亡的重要基因。

TCTE3，又稱tctex2，是tctex家族成員之一(該家族包括tctex、tctex1、tctex1L、tctex2、tctex2beta和tctex5)，編碼由198個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為23 000的蛋白質(zhì)，它含有4個內(nèi)含子,并與其他哺乳動物編碼的蛋白有87%的同源性[10]。 研究[11]表明TCTE3分布于精子尾部的整個長度。該研究結(jié)果顯示，精子中存在TCTE3 mRNA和蛋白的表達；特發(fā)性弱精子癥患者與正常男性相比，精子中TCTE3 mRNA和蛋白表達明顯下降，提示特發(fā)性弱精子癥患者精子中 TCTE3表達下降可能導致精子活力低下。TCTE3表達降低可能會引起精子鞭毛軸絲雙聯(lián)微管內(nèi)側(cè)輕鏈缺失，導致精子活力低下，最終導致不育癥的發(fā)生。然而，考慮到tctex1、tctex2表達的高度相似性，也許一種tctex表達的變化可能導致其他tctexs表達的改變，因此同時檢測tctexs家族成員在精子中的表達可更好地闡述其在影響精子活力方面的作用。

綜上所述，TCTE3作為一個新的標志物， 其表達的降低在特發(fā)性弱精子癥發(fā)病分子機制的研究中具有重大意義，但是精子中TCTE3 表達下調(diào)的機制以及與tctexs之間的相互作用有待于進一步的探索研究。

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(2013-04-03 收稿 責任編輯 李沛寰)

Expression of TCTE3 in spermatozoa of idiopathic asthenozoospermic patients

LIYushan,JIXiaofei,WANGQuanxian,YANGXianfeng,PANZhouhui,HUYaolong

HumanSpermBank,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

T-complex associated testis expressed 3;idiopathic asthenozoospermia;axonemal dynein

Aim:To explore the relationship of T-complex associated testis expressed 3(TCTE3) with idiopathic asthenozoospermia.Methods:The mRNA and protein expressions of TCTE3 in 30 cases of normal adult male and 30 cases of idiopathic asthenozoospermia semen samples were detected by using RT-PCR and Western blot. Results: The relative expression levels of TCTE3 mRNA and protein in the idiopathic asthenozoospermia group were significantly lower than those in the normal control group(t=3.038 and 2.460，P=0.005 and 0.017).Conclusion: The reduced expression of TCTE3 may play an important role in the incidence of idiopathic asthenozoospermia.

*鄭州市科技攻關計劃項目 2010S0828

R698.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.023