三七總皂苷對大鼠心肌梗死后血管新生及微小RNA-21表達的影響

樊清波，李小威，簡立國，秦秉玉

1)河南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科 鄭州 450003 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014

三七總皂苷對大鼠心肌梗死后血管新生及微小RNA-21表達的影響

樊清波1)，李小威2)#，簡立國2)，秦秉玉1)

1)河南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科 鄭州 450003 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014

#通訊作者，男，1985年12月生，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：冠心病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:15938779015@163.com

三七總皂苷；心肌梗死；大鼠；血管內(nèi)皮生長因子；微小RNA-21

目的：觀察三七總皂苷對大鼠心肌梗死后血管新生和VEGF、微小RNA-21(miRNA-21)表達的影響。方法108只健康Wistar大鼠結(jié)扎左冠狀動脈建立急性心肌梗死模型后分為心肌梗死對照組、三七總皂苷低劑量治療組和三七總皂苷高劑量治療組，心肌梗死對照組和三七總皂苷治療組分別于術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水和三七總皂苷(100和400 mg/kg)，術(shù)后3、7、14、21 d分別處死9只大鼠，進行心肌梗死面積百分比測定，免疫組化法測定梗死周邊區(qū)微血管密度和VEGF蛋白相對表達量，RT-PCR法檢測miRNA-21、VEGF mRNA相對表達量。結(jié)果3組3、7、14及21 d梗死周邊區(qū)微血管密度、心肌梗死面積百分比、VEGF蛋白相對表達量、VEGF和miRNA-21 mRNA相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F微血管密度=35.163、42.906、49.510、54.245，P均<0.001；F梗死面積百分比=59.358、68.241、66.350、58.667，P均<0.001；FVEGF 蛋白=145.576、164.024、179.349、186.362，P均<0.001;FVEGF mRNA=253.542、268.958、315.313、347.914，P均<0.001;FmiRNA-21 mRNA=53.421、67.954、72.358、75.694，P均<0.001)。與心肌梗死對照組相比，三七總皂苷治療組微血管密度、VEGF蛋白、VEGF和miRNA-21 mRNA相對表達量均升高(P均<0.05)，心肌梗死面積百分比減少(P均<0.05)；不同劑量三七總皂苷治療組上述各指標比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。各組梗死周邊區(qū)miRNA-21、VEGF mRNA的相對表達量間均呈正相關(guān)(r心肌梗死對照組=0.609，P=0.036；r三七總皂苷低劑量治療組=0.522，P=0.047；r三七總皂苷高劑量治療組=0.581，P=0.042)。結(jié)論三七總皂苷有促進心肌梗死后VEGF和miRNA-21表達、促進血管新生和縮小梗死面積的作用。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是臨床常見的急危重疾病。近年來AMI后再血管化治療取得了令人矚目的成就，然而合并冠狀動脈彌漫性病變、多次手術(shù)及遠端過細的患者往往失去了再血管化治療的機會，因此治療性血管新生成為這些患者新的治療方式。三七總皂苷是三七的主要成分之一。研究證明，三七總皂苷可改善心肌缺血再灌注損傷[1]，增加腦梗死后側(cè)支循環(huán),改善缺血部位血流供應(yīng)[2]，因此推測三七總皂苷可促進心肌梗死后血管新生。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成過程中重要的調(diào)節(jié)因子；微小RNA(miRNA)是真核細胞中參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA，其中miRNA-21參與新生血管的內(nèi)膜形成[3]。該實驗通過觀察三七總皂苷對大鼠心肌梗死后血管新生和VEGF、miRNA-21表達的影響，探討其促血管新生的分子機制。

1 材料與方法

1.1藥物、主要試劑及儀器三七總皂苷粉(昆明圣火制藥有限責任公司)，SP免疫組化試劑盒及抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，大鼠VEGF引物序列、內(nèi)參β-actin引物序列(武漢博士德生物工程有限責任公司)，Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，miRNA-21、內(nèi)參U6引物、ALL-in-One miRNA PCR檢測試劑盒(GeneCoporia公司)，小動物呼吸機(江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司)，顯微鏡、彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)，石蠟切片機(德國蔡司公司)，MFLLab200心功能記錄儀。

1.2動物造模及分組健康雄性Wistar大鼠108只(河南省實驗動物中心提供，合格證號：410116)，體重(200±20) g，(3.1±0.6)個月，采用隨機數(shù)字表法分為心肌梗死對照組、心肌梗死后三七總皂苷低劑量治療組和三七總皂苷高劑量治療組。參考文獻[4]方法，體積分數(shù)10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，常規(guī)背位固定，連接多導(dǎo)生理信號采集處理系統(tǒng)，經(jīng)口氣管插管，接小動物呼吸機。左前胸常規(guī)備皮、消毒，在左側(cè)第3、4肋處橫向切開皮膚，鈍性分離肌層，沿第3肋或第4肋間隙打開胸腔，以開胸器擴大手術(shù)視野，切開心包，在動脈圓錐與左心耳下約1 mm處用線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，觀察前壁心肌組織顏色由鮮紅迅速變?yōu)榘导t，隨后逐漸變?yōu)榘咨?，心電圖監(jiān)測Ⅰ和avL導(dǎo)聯(lián)ST段較前上抬>0.2 mV 提示手術(shù)成功。心臟重置于胸腔，分層縫合胸壁。術(shù)后腹腔注射青霉素3 d抗感染，心肌梗死對照組及藥物治療組術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水和三七總皂苷(100和400 mg/kg)，術(shù)后3、7、14、21 d分別處死大鼠，每組9只，在乳頭肌橫切面處切取心肌組織，經(jīng)中性甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切成4～5 μm厚組織切片。

1.3大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌血管新生情況的免疫組化法觀察將上述組織切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體進行免疫組化染色，計數(shù)梗死區(qū)微血管數(shù)目，免疫組化步驟按照說明書進行。微血管計數(shù)標準參考文獻[5]，血管腔以及紅細胞出現(xiàn)并不是計數(shù)必需結(jié)構(gòu)，凡染成棕色的單個內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮細胞叢均被看作一個微血管。具體方法為低倍鏡下找到梗死周邊區(qū)組織，切換為200倍鏡后觀察并計數(shù)微血管，每張切片觀察5個視野，取均數(shù)。

1.4大鼠心肌組織梗死面積百分比測定各組處死大鼠后，中性甲醛溶液灌流固定后取出心臟，沿左室短軸橫切，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察，采用圖像分析系統(tǒng)檢測心肌梗死面積和左室心肌面積，梗死面積百分比=心肌梗死面積/左室心肌面積×100%。

1.5大鼠心肌梗死周邊區(qū)VEGF蛋白的表達情況

將組織切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體進行免疫組化染色，以梗死周邊區(qū)細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF陽性，采用圖像分析系統(tǒng)測定梗死周邊區(qū)400倍視野下的光密度值，每張切片觀察7個視野，取均數(shù)作為VEGF蛋白的相對表達量。

1.6大鼠心肌梗死周邊區(qū)miRNA-21、VEGFmRNA的表達情況總RNA提取參照Trizol試劑盒說明書進行。每個樣本取1 μg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA。VEGF引物序列：上游5’-AGAAGG AGGAGGGCAGAATCA-3’，下游5’-CAAATGCTTTCT CCGCTCTGA-3’，擴增片段大小326 bp；β-actin引物序列：上游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’，下游5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，擴增片段大小471 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.6 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統(tǒng)測定吸光度值與β-actin的比值即代表VEGF mRNA的相對表達量。miRNA-21引物序列：上游5’-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’，下游5’-GACT GTGACGACTACCCCAA-3’，擴增片段大小75 bp；U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，擴增片段大小109 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)溶解度曲線單峰驗證，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號達到所設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)，ΔΔCt=(CtmiRNA-21-CtU6)治療組-(CtmiRNA-21-CtU6)對照組，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析，計算miRNA-21與內(nèi)參U6比值作為miRNA-21 mRNA的相對表達量。

1.7統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 13.0進行分析。3組間心肌梗死周邊區(qū)微血管密度、梗死面積百分比、VEGF蛋白、miRNA-21和VEGF mRNA相對表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；各組miRNA-21、VEGF mRNA相對表達量、微血管密度間的關(guān)系采用Pearson積差相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)微血管密度比較三七總皂苷治療組心肌梗死周邊區(qū)微血管密度高于心肌梗死對照組，且三七總皂苷高劑量治療組高于三七總皂苷低劑量治療組，見圖1、表1。

圖1 各組大鼠術(shù)后3 d心肌梗死周邊區(qū)微血管新生情況(SP，×200)

表1 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)微血管密度比較(n=9) 個/視野

*：與心肌梗死對照組比較，P<0.05；△：與三七總皂苷低劑量治療組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠心肌組織梗死面積百分比比較三七總皂苷治療組心肌組織梗死面積百分比均低于心肌梗死對照組，且三七總皂苷低劑量治療組高于三七總皂苷高劑量治療組，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織梗死面積百分比比較(n=9) %

*：與心肌梗死對照組比較，P<0.05；△：與三七總皂苷低劑量治療組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)VEGF蛋白相對表達量比較結(jié)果見表3。3組間VEGF蛋白相對表達量比較及組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義。

表3 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)VEGF蛋白相對表達量比較(n=9)

*：與心肌梗死對照組比較，P<0.05；△：與三七總皂苷低劑量治療組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)miRNA-21、VEGFmRNA相對表達量比較結(jié)果見圖2和表4、5。

圖2 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)VEGF mRNA表達檢測結(jié)果

表4各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)VEGFmRNA的相對表達量比較(n=9)

組別3d7d14d21d心肌梗死對照組0．74±0．100．82±0．110．84±0．130．86±0．09三七總皂苷低劑量治療組1．15±0．17?1．29±0．23?1．36±0．18?1．41±0．15?三七總皂苷高劑量治療組1．32±0．24?△1．69±0．28?△1．77±0．14?△1．89±0．31?△F253．542268．958315．313347．914P<0．001<0．001<0．001<0．001

*：與心肌梗死對照組比較，P<0.05；△：與三七總皂苷低劑量治療組比較，P<0.05。

表5 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)miRNA-21 mRNA的相對表達量比較(n=9)

*：與心肌梗死對照組比較，P<0.05；△：與三七總皂苷低劑量治療組比較，P<0.05。

2.5各組miRNA-21、VEGFmRNA相對表達量、微血管密度間相關(guān)性分析各組梗死周邊區(qū)miRNA-21、VEGF mRNA相對表達量呈正相關(guān)(r心肌梗死對照組=0.609，P=0.036；r三七總皂苷低劑量治療組=0.522，P=0.047；r三七總皂苷高劑量治療組=0.581，P=0.042)。各組梗死周邊區(qū)miRNA-21 mRNA相對表達量與微血管密度呈正相關(guān)(r心肌梗死對照組=0.514，P=0.041；r三七總皂苷低劑量治療組=0.528，P=0.019；r三七總皂苷高劑量治療組=0.625，P=0.014)。各組梗死周邊區(qū)VEGF mRNA相對表達量與微血管密度呈正相關(guān)(r心肌梗死對照組=0.590，P=0.021；r三七總皂苷低劑量治療組=0.564，P=0.008；r三七總皂苷高劑量治療組=0.657，P=0.010)。

3 討論

AMI是冠狀動脈急性、持續(xù)缺血缺氧所引起的心肌壞死，經(jīng)皮冠狀動脈血管腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動脈支架植入術(shù)及冠狀動脈旁路移植術(shù)等方法是臨床治療AMI常見且有效的方法，而對于直徑<2 mm的血管，上述治療方法無法獲益。近年來，促進缺血區(qū)血管新生成為研究熱點[6-8]。Sasaki等[9]研究發(fā)現(xiàn)使用生長因子類基因產(chǎn)物可刺激缺血心肌組織新生血管形成；Hattori等[10]發(fā)現(xiàn)自體骨髓干細胞移植可促進嚴重缺血心肌組織血管形成，藥物治療特別是中藥制劑也可促進側(cè)支循環(huán)形成[11]，實現(xiàn)缺血區(qū)自我搭橋。VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異性促有絲分裂原，是目前發(fā)現(xiàn)最特異的促進新生血管形成的生長因子，臨床和基礎(chǔ)實驗[12-14]均證明VEGF可促進側(cè)支循環(huán)的建立，改善心肌供血。miRNA可通過與靶mRNA結(jié)合，促進靶mRNA降解，對基因進行表達后轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與疾病的病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21具有促進新生血管內(nèi)膜形成[3]、縮小心肌梗死面積[15-17]、促進心臟肥大[18]及參與心肌纖維化形成等作用。

該研究結(jié)果表明，三七總皂苷治療組心肌梗死周邊區(qū)微血管密度高于心肌梗死對照組，且三七總皂苷高劑量治療組高于三七總皂苷低劑量治療組。梗死周邊區(qū)VEGF蛋白的相對表達量同微血管密度呈正相關(guān)，三七總皂苷治療組VEGF蛋白及mRNA的相對表達量均高于心肌梗死對照組，提示三七總皂苷可通過上調(diào)VEGF的表達進而促進梗死周邊區(qū)新生血管形成。心肌梗死后VEGF表達增加雖然可促進梗死周邊區(qū)新生血管形成，但同時也增加新生血管通透性，不利于功能血管形成，梗死周邊區(qū)微血管密度增加提示存在其他因子參與新生血管形成。該研究中心肌梗死對照組梗死周邊區(qū)miRNA-21 mRNA的相對表達量均低于三七總皂苷治療組，且miRNA-21 mRNA的相對表達量與微血管密度呈正相關(guān)，提示miRNA-21可能參與了新生血管形成，三七總皂苷可上調(diào)miRNA-21的表達促進梗死周邊區(qū)功能血管形成。

該研究中三七總皂苷治療組心肌梗死面積百分比均低于心肌梗死對照組，而miRNA-21 mRNA的相對表達量高于心肌梗死對照組，提示三七總皂苷可通過上調(diào)miRNA-21的表達減少心肌梗死面積百分比，這與文獻[15-17]結(jié)果一致。該實驗結(jié)果顯示miRNA-21與VEGF mRNA相對表達量呈正相關(guān)，可能的解釋是VEGF mRNA是miRNA-21的靶mRNA或者miRNA-21通過調(diào)控其他靶mRNA進而影響VEGF mRNA表達，其具體機制尚有待進一步研究。盡管該實驗證實了三七總皂苷有促進心肌梗死后VEGF和miRNA-21表達、促進梗死周邊區(qū)血管新生和縮小梗死面積百分比的作用，然而其具體機制還有待進一步研究，以為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(2013-06-24 收稿 責任編輯 姜春霞)

Effects of panax notoginseng saponins on angiogenesis and miRNA-21 expression in rats with myocardial infarction

FANQingbo1),LIXiaowei2),JIANLiguo2)，QINBingyu1)

1)DepartmentofCriticalCareMedicine,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 2)DepartmentofCardiology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

panax notoginseng saponin; myocardial infarction; rat; vascular endothelial growth factor; miRNA-21

Aim: To explore the effects of panax notoginseng saponins(PNS)on angiogenesis and VEGF, miRNA-21 expressions in rats with myocardial infarction.Methods: The left coronary artery of 108 male Wistar rats was ligated to make the models of acute myocardial infarction.All rats were randomly divided into myocardial infarction control group,low PNS group(100 mg/kg)and high PNS group(400 mg/kg). The microvascular density in the infarct area， VEGF protein, miRNA-21 and VEGF mRNA were detected at 3,7,14,21 day after operation.Results: At 3, 7, 14 and 21 day,there were significant differences in microvascular density,infarct areas,the expressions of VEGF protein,VEGF and miRNA-21 mRNA among the three groups(Fmicrovascular density=35.163, 42.906, 49.510, 54.245，P<0.001;Finfarct areas=59.358, 68.241, 66.350, 58.667，P<0.001;FVEGF protein=145.576,164.024,179.349,186.362，P<0.001;FVEGF mRNA=253.542, 268.958, 315.313, 347.914，P<0.001;FmiRNA-21 mRNA=53.421, 67.954, 72.358, 75.694，P<0.001).The infarct areas decreased significantly in PNS groups while the other 3 indexes increased compared with myocardial infarction control group(P<0.05).There were also significant differences in the above indexes between low PNS group and high PNS group(P<0.05).The expressions of miRNA-21 and VEGF mRNA in infarct areas had positive correlation(rmyocardial infarction control group=0.609,P=0.036;Flow PNS group=0.522,P=0.047；Fhigh PNS group=0.581,P=0.042).Conclusion: PNS could increase VEGF and miRNA-21 expression, improve angiogenesis and decrease infarct area after myocardial infarction.

R542.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.014