混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜的建立*

楊繼要,馮 若,金 輝,孫 蕓,丁 一

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 鄭州 450001

混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜的建立*

楊繼要,馮 若,金 輝,孫 蕓,丁 一#

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 鄭州 450001

#通訊作者，男，1963年10月生，博士，教授，研究方向：腫瘤生物學(xué)，E-mail：dingyi@zzu.edu.cn

肺腺癌；混合血清；雙向蛋白印跡圖譜

目的：建立混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜。方法收集2例肺腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本，提取癌組織可溶性總蛋白并雙向凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后分別與4例肺腺癌患者的混合血清和4例良性肺部疾病患者(對照)的混合血清孵育2 h，再加入二抗羊抗人IgG反應(yīng)2 h，DAB顯色。結(jié)果分別建立了肺腺癌混合血清和對照混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜，兩個圖譜之間存在明顯差異。結(jié)論利用混合血清孵育的肺腺癌組織總蛋白能建立良好的雙向蛋白印跡圖譜，這為進(jìn)一步鑒定肺腺癌腫瘤相關(guān)抗原奠定了基礎(chǔ)。

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，早期診斷是提高肺癌生存率的關(guān)鍵，對改善肺癌預(yù)后具有重要意義[1]。從腫瘤免疫學(xué)來看，腫瘤細(xì)胞是“非己細(xì)胞”，總是或多或少地表達(dá)區(qū)別于正常細(xì)胞的腫瘤抗原，因而在患者血清中極有可能存在相應(yīng)的抗體[2-3]。腫瘤血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法是蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤免疫學(xué)結(jié)合的方法[4]，該方法結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)能同時分離腫瘤組織(細(xì)胞)大量蛋白質(zhì)的優(yōu)勢和免疫反應(yīng)高度特異性的特點(diǎn)，可快速篩選出與腫瘤免疫密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而鑒定出腫瘤的分子標(biāo)志物。該方法為尋找新型肺癌早期診斷指標(biāo)提供了有效途徑[4]。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離蛋白質(zhì)的核心方法[5]。作者應(yīng)用混合血清孵育肺腺癌組織，建立肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜，為進(jìn)一步篩選和鑒定肺腺癌腫瘤相關(guān)抗原打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣本來源4例肺腺癌、4例良性肺部疾病患者血清和2例經(jīng)病理學(xué)鑒定為肺腺癌的手術(shù)標(biāo)本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.2主要試劑與設(shè)備IPG預(yù)制干膠條(pH5～8，11 cm)、尿素、硫脲、礦物油、兩性電解質(zhì)(Bio-lyte Ampholyte 3-10)、雙向電泳系統(tǒng)(Protean IEF Cell等電聚焦儀，Protean ⅡXi Cell垂直電泳儀)及Gs-800圖像獲取儀均為BioRad公司產(chǎn)品,四甲基乙二胺、Tris-Base、碘乙酰胺、CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、抑肽酶均為Sigma公司產(chǎn)品，孔徑0.22 μm硝酸纖維素膜購自Millipore公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3肺腺癌組織可溶性總蛋白的提取及濃度測定

用消毒剪刀將肺腺癌組織塊剪碎后，放入組織勻漿器中，加入組織裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/L CHAPS，100 mmol/L DTT，2 g/L兩性電解質(zhì)，0.5 mmol/L EDTA，1 mg/L抑肽酶)，在冰上充分研碎組織，BradFord標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.4雙向蛋白印記圖譜的建立取11 cm的IPG預(yù)制干膠條數(shù)條，膠面向下分別放置于電聚焦盤中不同泳道的蛋白樣品溶液上，開始第一向等電聚焦電泳，程序如下：50 V主動水化16 h，250 V除鹽1 h，1 000 V除鹽1 h，升壓5 h至10 000 V，聚焦至40 000 Vh完成；第二向SDS-PAGE電泳條件如下：壓縮電流10 mA/膠，分離電流30 mA/膠。雙向電泳完成后，裁與凝膠大小相符的硝酸纖維素膜對凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜置于麗春紅染液染色數(shù)秒，驗證轉(zhuǎn)膜效果。取4例肺腺癌患者的血清，每例取500 μL，混合為2 mL，按19的比例加入18 mL的封閉液混合；4例良性肺部疾病患者(對照)的血清按同樣方法處理。將2張硝酸纖維素膜分別放入肺腺癌患者和對照血清中室溫孵育2 h，然后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG室溫反應(yīng)2 h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1雙向凝膠轉(zhuǎn)膜效果雙向凝膠轉(zhuǎn)膜完成、麗春紅染色后，膜上能看到大、中、小相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，證明雙向凝膠轉(zhuǎn)膜效果較好(圖1)。

圖1 雙向凝膠轉(zhuǎn)膜后的麗春紅染色圖

2.2雙向蛋白印記圖譜見圖2、3。通過比較可以看出，二者之間存在明顯差異。以兩種圖譜中均可以找到的A、B、C 3點(diǎn)作為標(biāo)志點(diǎn)，肺腺癌圖譜中，A點(diǎn)左下方、B點(diǎn)右下方、BC點(diǎn)連線上方的區(qū)域中均有Western blot反應(yīng)蛋白的存在，而對照圖譜中則沒有。

圖2 肺腺癌患者混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜

圖3 良性肺部疾病患者混合血清孵育的肺腺癌組織雙向蛋白印跡圖譜

3 討論

腫瘤血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的優(yōu)勢。利用雙向蛋白印跡技術(shù)分離腫瘤和正常組織蛋白，篩選差異表達(dá)蛋白，可為篩選和鑒定腫瘤相關(guān)抗原打下基礎(chǔ)[6]。在應(yīng)用腫瘤血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法建立其他腫瘤蛋白印跡圖譜的研究中，通常采用單個血清(按50～100倍稀釋)孵育硝酸纖維素膜[7-9]，該實(shí)驗中作者采用混合血清作為一抗對承載肺腺癌組織總蛋白的硝酸纖維素膜進(jìn)行孵育。選用混合血清而不是單個血清主要是出于以下考慮：首先，由于個體間存在差異，并不是每個患者都會產(chǎn)生針對某種抗原的抗體并出現(xiàn)在血清中，如果每例血清都做孵育的話，勢必增加實(shí)驗次數(shù)，而雙向電泳及轉(zhuǎn)膜次數(shù)越多，誤差也就越大，可能會造成蛋白質(zhì)在凝膠和硝酸纖維素膜上的位置發(fā)生變化，原本相同的反應(yīng)點(diǎn)因位置變化，可能被認(rèn)定為不同的反應(yīng)點(diǎn)，增加了蛋白質(zhì)點(diǎn)比對的難度；再者，從每個患者取得的化療前血清標(biāo)本有限，而孵育較大的雙向硝酸纖維素膜需要較多的一抗孵育液，單個患者的血清不能徹底浸泡雙向硝酸纖維素膜；最后，混合血清的使用由于減少相同實(shí)驗的次數(shù)而可以降低實(shí)驗成本?；谝陨蠋c(diǎn)原因，作者采取4例肺腺癌患者血清各0.5 mL混合，加入18 mL的封閉液，使總血清與總體積的比值為110(單個血清與總體積的比值常為140)，在這個比值范圍內(nèi)，各血清內(nèi)若有共同的抗體存在則可以充分與硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)反應(yīng)，而每個血清中的個體特異性抗體也可與其相應(yīng)的抗原反應(yīng)，而且所有反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示在同一張膜上，使差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的軟件分析和人工比對工作更為容易。該研究中，作者制備了用肺腺癌患者混合血清和良性肺部疾病患者的混合血清，分別與2例肺腺癌組織總蛋白反應(yīng)，建立了雙向蛋白印跡圖譜，通過比對兩個圖譜找到只與肺腺癌血清反應(yīng)的差異點(diǎn)，這為下一步篩選和鑒定肺腺癌腫瘤相關(guān)抗原打下了實(shí)驗基礎(chǔ)。

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(2013-03-27 收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

Establishment of 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera

YANGJiyao，F(xiàn)ENGRuo，JINHui，SUNYun，DINGYi

DepartmentofHistologyandEmbryology，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

lung adenocarcinoma;mixed sera; 2-dimensional Western blot map

Aim: To establish the 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera. Methods: The soluble proteins of lung adenocarcinoma tissue samples from 2 patients were extracted and separated by 2-dimensional electrophoresis, then transferred onto nitrocellulous membranes. After having reacted with mixed sera from 4 lung adenocarcinoma patients or 4 patients with benign lung disease for 2 h, respectively, the nitrocellulous membranes were incubated with goat anti human IgG as the second antibody for 2 h, then DAB kit revealed the results of reaction. Results: 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera from lung adenocarcinoma and benign lung disease patients were established successfully, and the differences between the two maps were showed. Conclusion: The excellent 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera can be built up, which will lay the foundation for the following identification of tumor-associated antigens in lung cancer.

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目 200903005

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.013