褪黑素對大鼠脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響*

徐玉生，張 松，金偉林，李星晨，崔 浩,王培松，文建國

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

褪黑素對大鼠脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響*

徐玉生1)△，張 松1)，金偉林1)，李星晨1)，崔 浩1),王培松1)，文建國2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

△男，1969年3月生，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：骨科疾病的基礎(chǔ)與臨床， E-mail: ysxu@zzu.edu.cn

脊髓損傷；褪黑素；腫瘤壞死因子-α；大鼠

目的：探討褪黑素(MT)對脊髓損傷(SCI)大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)的影響及可能機(jī)制。方法108只SD大鼠隨機(jī)分為3組。假手術(shù)(Sham)組僅行椎板切除不損傷脊髓，SCI組與SCI+MT組采用改良的Allen’s法建立SCI模型；SCI+MT組術(shù)后10 min腹腔注射MT(100 mg/kg)，SCI組注射等量體積分?jǐn)?shù)5%乙醇。術(shù)后12 h各組選6只取脊髓，采用HE染色法和免疫組化法分別觀察脊髓組織的病理變化和TNF-α蛋白的表達(dá)情況。術(shù)后1、12、24、48、72 h，各組分別取6只大鼠，用ELISA法檢測血清TNF-α水平，RT-PCR法測定脊髓組織 TNF-α mRNA的表達(dá)。結(jié)果SCI+MT組病理改變較SCI組明顯減輕。脊髓組織中TNF-α蛋白主要分布在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞核；3組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=504.239，P<0.001)，其中SCI組最高，SCI+MT組次之，Sham組最低。各時(shí)間點(diǎn)3組血清TNF-α水平和脊髓組織中TNF-α mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，其中SCI+MT組上述2指標(biāo)低于SCI組，但仍高于Sham組(P<0.05)。結(jié)論MT可能通過抑制TNF-α的表達(dá)水平減輕損傷脊髓的繼發(fā)性炎癥損傷。

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI) 包括原發(fā)性損傷及由原發(fā)性因素導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷。SCI后大量的炎性細(xì)胞浸潤及大量炎癥因子的產(chǎn)生是導(dǎo)致脊髓繼發(fā)性損傷的主要因素。控制繼發(fā)性損傷是SCI早期治療的重要目標(biāo)之一[1]。近年來, 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在脊髓繼發(fā)性損傷中的作用逐漸受到重視,被認(rèn)為是眾多炎癥因子的始動(dòng)因子，能上調(diào)其他炎癥因子的產(chǎn)生, 在局部炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有重要意義[2]。目前治療SCI最常用的藥物是甲基強(qiáng)的松龍，但大劑量的甲基強(qiáng)的松龍可引起一系列并發(fā)癥，如感染、高血壓、急性胃潰瘍等。褪黑素(melatonin,MT)是一種由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功能[3-4]。作者觀察了MT對SCI后不同時(shí)期炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確MT對SCI后炎癥反應(yīng)影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及分組SPF級健康成年雌性SD大鼠108只，體重(300±20) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。 按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)(Sham)組、SCI+MT組、SCI組，每組36只。術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑與儀器Trizol試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒和Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物購自北京博大泰克公司。大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫(ELISA)分析試劑盒購自美國RD公司。兔抗鼠TNF-α抗體、免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。MT、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司。PCR 擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司，型號：2700)，低溫離心機(jī)(美國Sigma公司，型號：3K30)，D-140圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific，型號：D140)。

1.3動(dòng)物模型的建立體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 必要時(shí)追加。麻醉生效后，俯臥固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)備皮，以T12為中心，常規(guī)消毒、鋪巾，背部正中切口，顯露T11至T13，咬除該節(jié)段棘突及椎板，暴露相應(yīng)脊髓段作為損傷區(qū)，于硬膜上方放置一長方形塑料墊片(0.4 mm×0.3 mm×0.1 mm)，再采用改良的Allen′s法[5]，將5 g砝碼從高度10 cm處通過導(dǎo)管自由落下，對大鼠脊髓進(jìn)行定量打擊，建立大鼠急性SCI模型。局部見：打擊處脊髓組織出現(xiàn)水腫、淤血但硬脊膜完整；整體見：大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)后，雙后肢呈遲緩性癱瘓，表明撞擊成功。隨后用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、皮膚。MT按說明書要求，用無水乙醇進(jìn)行稀釋。術(shù)后10 min，SCI+MT組腹腔注射MT 100 mg/kg，SCI組給予等量含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的生理鹽水。Sham組僅咬除棘突及椎板，并未損傷脊髓。術(shù)后人工手法壓迫幫助大鼠排尿(白天每4 h 1次)，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。

1.4 3組大鼠脊髓組織病理表現(xiàn)及TNF-α蛋白表達(dá)的檢測術(shù)后12 h每組選取6只大鼠，腹腔注射麻醉后分別用生理鹽水和40 g/L的多聚甲醛行升主動(dòng)脈灌流固定，以損傷段為中心取約1.5 cm的脊髓組織，40 g/L多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋、切片。HE染色觀察脊髓的病理表現(xiàn)。每個(gè)標(biāo)本取同序列切片5張，按照免疫組化試劑盒說明書要求進(jìn)行TNF-α檢測，以兔抗鼠TNF-α抗體(按200倍稀釋)為一抗，以PBS代替一抗作陰性對照。細(xì)胞質(zhì)及胞核染成黃褐色或黑色為陽性細(xì)胞，每張切片計(jì)數(shù)4個(gè)高倍鏡視野中的陽性細(xì)胞數(shù)，取均值代表該張切片TNF-α蛋白的表達(dá)水平。

1.5 3組大鼠血清TNF-α水平及脊髓組織TNF-αmRNA表達(dá)的檢測術(shù)后1、12、24、48及72 h，每組選取6只大鼠處死。每例樣本取10 μL血清，采用ELISA法檢測TNF-α，按試劑盒說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TNF-α的含量。取損傷段脊髓組織于液氮中保存。每例樣本稱取100 mg凍存的脊髓組織，研碎后加入1 mL Trizol試劑，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。取2 mL cDNA按試劑盒說明進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參。TNF-α上游引物為5’-GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3’，下游引物為5’-TTCCCTTCACAGAGCAAT-3’, 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為451 bp。GAPDH上游引物為5’-CGTATCGGACGCCTG GTT-3’，下游引物為5’-CGGAGATGATGACCCTTTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為331 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的基因的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組大鼠脊髓組織TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)、血清TNF-α水平和脊髓組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后一般情況Sham組較術(shù)前無明顯變化，無神經(jīng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)。術(shù)后早期，SCI組及SCI+MT組大鼠進(jìn)食及活動(dòng)明顯減少，均出現(xiàn)不同程度的尿潴留情況，行走時(shí)后肢處于拖動(dòng)狀態(tài)；隨著觀察時(shí)間的延長，SCI+MT組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食較SCI組有改善，但后肢運(yùn)動(dòng)功能未見明顯改變。

2.2 3組大鼠脊髓組織病理表現(xiàn)和TNF-α蛋白的表達(dá)Sham組脊髓組織無充血水腫等變化。SCI組脊髓組織血管充血，細(xì)胞水腫，脊髓灰質(zhì)中部分細(xì)胞核濃縮，染色增強(qiáng)，白質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤及少量紅細(xì)胞滲出；TNF-α蛋白表達(dá)明顯增加，主要存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，散在分布在損傷區(qū)周圍。SCI+MT組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病理改變均較SCI組輕，TNF-α蛋白的表達(dá)亦減少。見圖1。TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)由高到低依次為SCI組(13.8±0.5)、SCI+MT組(10.3±0.6)和Sham組(3.9±0.2)，3組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=504.239,P<0.001)，且組間兩兩比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 3組大鼠術(shù)后12 h時(shí)病理表現(xiàn)和TNF-α蛋白的表達(dá)

2.3 3組大鼠血清TNF-α水平的比較SCI組和SCI+MT組血清TNF-α水平在術(shù)后12 h達(dá)高峰。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，SCI+MT組血清TNF-α水平低于SCI組，但仍高于Sham組。見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平(n=6)

*:與Sham組比較,P<0.001;#:與SCI組比較,P<0.001。

2.4 3組大鼠脊髓組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平的比較SCI組和SCI+MT組脊髓組織中TNF-α mRNA的表達(dá)水平在術(shù)后12 h達(dá)高峰。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，SCI+MT組脊髓組織中TNF-α mRNA的表達(dá)水平低于SCI組，但仍高于Sham組。見圖2、3，表2。

圖2 SCI+MT組脊髓組織TNF-α mRNA的表達(dá)

圖3 3組大鼠術(shù)后12 h脊髓組織TNF-α mRNA的表達(dá)

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織TNF-αmRNA檢測結(jié)果(n=6)

組別1h12h24h48h72hSham組0．102±0．0050．110±0．0070．104±0．0060．102±0．0100．101±0．006SCI組0．407±0．011?0．841±0．035?0．688±0．028?0．329±0．009?0．190±0．007?SCI+MT組0．269±0．007?#0．518±0．013?#0．414±0．019?#0．201±0．012?#0．123±0．008?#F1944．0001639．0001244．000615．938224．640P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

*:與Sham組比較，P<0.001;#:與SCI組比較，P<0.001。

3 討論

急性SCI后可引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)等病理生理過程, 導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。阻斷繼發(fā)性損傷是SCI早期治療最重要的目標(biāo)之一。

TNF-α是具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子, 在炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用。有研究[6-8]表明SCI后血中TNF-α持續(xù)高表達(dá)且是最早升高的細(xì)胞因子，可上調(diào)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與了脊髓繼發(fā)性損傷的過程。TNF-α能誘導(dǎo)花生四烯酸、脂質(zhì)過氧化物及氧自由基的產(chǎn)生，上述物質(zhì)能損傷細(xì)胞膜并能增加血管的通透性，這些特性可能與SCI后水腫形成的機(jī)制有關(guān)[9]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCI后12 h，損傷脊髓組織血管充血，細(xì)胞水腫，組織內(nèi)TNF-α表達(dá)明顯增加，且主要表達(dá)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，彌散分布在損傷區(qū)周圍；血清TNF-α水平和脊髓組織TNF-α mRNA表達(dá)水平達(dá)高峰；說明TNF-α可能參與了脊髓繼發(fā)性損傷過程。因此控制TNF-α的高表達(dá)對減輕脊髓繼發(fā)性損傷有重要意義。

MT具有高度的脂溶性和水溶性，能透過核膜進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，因此不僅能保護(hù)膜脂質(zhì)，還能保護(hù)蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞其他成分[10]。作者的前期實(shí)驗(yàn)[11]結(jié)果顯示MT能夠提高損傷脊髓抗炎因子IL-10的表達(dá)水平，達(dá)到保護(hù)損傷脊髓的作用。也有文獻(xiàn)[12-13]證實(shí)MT有鎮(zhèn)痛作用，并能直接清除自由基，抑制髓過氧化物酶，減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的毒性損害，具有一定的抗炎作用。相關(guān)研究[14]證實(shí)MT在肺的煙霧吸入性損傷模型中能夠抑制TNF-α的表達(dá)。該研究結(jié)果顯示SCI組術(shù)后血清TNF-α表達(dá)水平較Sham組明顯升高，說明由于術(shù)后血脊髓屏障的破壞，來源于血液中高濃度的TNF-α可能參與了脊髓的繼發(fā)性損傷。SCI+MT組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α含量及脊髓組織TNF-α mRNA的表達(dá)均低于SCI組，脊髓組織TNF-α蛋白的表達(dá)明顯減少，局部組織炎癥反應(yīng)減輕。以上結(jié)果證明MT能降低SCI后TNF-α的表達(dá)水平，從而減輕SCI后的炎癥反應(yīng)，對損傷脊髓有保護(hù)作用。

MT對SCI保護(hù)性治療作用的研究還處于初級階段。作者在前期實(shí)驗(yàn)[11]探討了MT對抗炎因子的促進(jìn)作用，而該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MT能抑制促炎因子TNF-α的表達(dá)，進(jìn)一步證明了MT對SCI大鼠有保護(hù)作用,對SCI的科研及臨床治療有重要的參考意義。該實(shí)驗(yàn)僅初步探討了MT對SCI后TNF-α表達(dá)的影響，仍有不足之處，如只觀察了MT對單一炎癥因子表達(dá)的影響，其中的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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(2013-08-22 收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

Effects of melatonin on expression of TNF-α in rats with acute spinal cord injury

XUYusheng1),ZHANGSong1),JINWeilin1),LIXingchen1),CUIHao1),WANGPeisong1),WENJianguo2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)InstituteofClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

spinal cord injury; melatonin; tumor necrosis factor-α;rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in acute spinal cord injury(SCI) rats. Methods:A total of 108 SD rats were randomly allocated into three groups:Sham group only accepted laminectomy without SCI， and SCI group and SCI+MT group used the modified Allen's method to establish SCI model. 100 mg/kg MT was given to the rats in SCI+MT group, and 5% ethanol, to SCI group at 10 min after the model establishment．At 12 h, spinal cord samples of 6 rats from each group were prepared for histological examination using HE and immunohistochemical SP staining to detect the expression of TNF-α. At 1,12,24,48 and 72 h, 6 rats in each group were executed,the serum level of TNF-α was determined by ELISA, and the expression of TNF-α mRNA was detected by RT-PCR.Results: Compared with SCI group,the pathological changes in SCI+MT group were significantly alleviated.Immunohistochemical staining showed that TNF-α protein in spinal cord tissue mainly located in the cytoplasm and nucleus of neurons and glial cells;SCI group was the highest，SCI+MT group followed, and Sham group was the lowest(F=504.239，P<0.001). At different time points, the serum level of TNF-α and the expression of TNF-α in spinal cord tissue in SCI+MT group were significantly lower than those in SCI group, but still higher than those in Sham group(P<0.05). Conclusion: MT may reduce secondary injury of SCI by inhibiting the expression of TNF-α.

*鄭州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 2010S0828

R681.5+4

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.012