葡萄籽原花青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

趙雅寧，曹書華，郭 霞，王紅陽(yáng)

1)天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津 300000 2)河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 唐山063000 3)天津市第一中心醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)研究所 天津 300000

葡萄籽原花青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

趙雅寧1，2)，曹書華3)#，郭 霞2)，王紅陽(yáng)2)

1)天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津 300000 2)河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 唐山063000 3)天津市第一中心醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)研究所 天津 300000

#通訊作者，男，1945年10月生，主任醫(yī)師，教授，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)，E-mail：zyning789@126.com

間歇性低氧；p38MAPK；IL-1β；學(xué)習(xí)記憶能力；葡萄籽原花青素；大鼠

目的：探討葡萄籽原花青素對(duì)慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法56只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和葡萄籽原花青素高、低劑量干預(yù)組。對(duì)照組暴露于空氣中，余3組制備慢性間歇性低氧模型(低氧處理6周)。葡萄籽原花青素高和低劑量干預(yù)組在低氧處理前2周開(kāi)始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100 mg·kg-1。低氧處理第2和6周，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，電鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，免疫印跡法檢測(cè)海馬區(qū)腦組織磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，腦組織p-p38MAPK 和IL-1β表達(dá)升高，水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)。與模型組比較，葡萄籽原花青素干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷減輕，腦組織p-p38MAPK和IL-1β表達(dá)水平降低，水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期縮短、穿臺(tái)次數(shù)增多(P<0.05)；高劑量干預(yù)組變化更為顯著(P<0.05)。結(jié)論葡萄籽原花青素可能通過(guò)減輕腦組織炎癥反應(yīng)，改善慢性間歇性低氧大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep aplnea-hypopnea syndrome, OSAHS)可造成患者警覺(jué)、執(zhí)行能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知障礙[1-2]。OSAHS神經(jīng)損傷機(jī)制復(fù)雜。臨床資料[3]顯示OSAHS患者體內(nèi)存在明顯的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而炎癥反應(yīng)在缺血缺氧性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與認(rèn)知障礙的形成密切相關(guān)。原花青素是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，屬于植物多酚類物質(zhì)，以葡萄籽中含量最為豐富。研究[4-7]表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、保護(hù)心血管、降血脂、抗腫瘤等功能。作者采用濃度結(jié)合時(shí)間切換的方式建立慢性間歇性缺氧大鼠模型，模擬臨床睡眠呼吸暫停的低氧狀態(tài)，探討葡萄籽原花青素對(duì)低氧大鼠腦組織磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和IL-1β蛋白表達(dá)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料雄性SD大鼠56只購(gòu)于北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003，體重310～350 g。p-p38MAPK單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，IL-1β多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。H-7650透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品，數(shù)字測(cè)氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)，低氧控制程序和低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué))，純氮(天津六方氣體高科技有限公司)。

1.2慢性間歇性低氧大鼠模型的建立[8]每天8：00～16：00將大鼠置于模型艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂涂諝?，每次循環(huán)2 min，連續(xù)給予氮?dú)?0 s，維持艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)最低至5%，隨后均復(fù)氧至21%。用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度，使艙內(nèi)氧濃度維持在規(guī)定濃度±0.5%以內(nèi)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組將56只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和葡萄籽原花青素高、低劑量干預(yù)組，每組14只。模型組：按1.2方法制備模型；對(duì)照組：每天也將動(dòng)物置于模型艙內(nèi)，但暴露于正?？諝庵?；高、低劑量干預(yù)組：在造模前2周開(kāi)始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100 mg·kg-1，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察在低氧處理第2和6周，每組分別隨機(jī)抽取2只動(dòng)物，常規(guī)麻醉，開(kāi)胸、暴露心臟，用混合固定液灌流心臟，斷頭取腦，取海馬區(qū)腦組織，參照文獻(xiàn)[8]處理，透射電鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.5學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定在低氧處理第2和6周，每組分別隨機(jī)抽取5只動(dòng)物，按照Smith等[9]的方法，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)。記錄大鼠逃避潛伏期及撤去平臺(tái)后動(dòng)物穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)(穿臺(tái)次數(shù))[8]。

1.6腦組織p-p38MAPK和IL-1β蛋白的檢測(cè)水迷宮實(shí)驗(yàn)后處死大鼠，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)腦組織，Western blot法檢測(cè)p-p38MAPK和IL-1β蛋白，抗體分別稀釋2 000和1 000倍。ECL 顯色。采用Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶平均灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿臺(tái)次數(shù)、腦組織p-p38MAPK和IL-1β蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形狀規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，胞核形狀規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)均勻，電子透明度高。模型組神經(jīng)細(xì)胞外形不規(guī)則，多數(shù)線粒體嵴斷裂、減少甚至出現(xiàn)大量空泡，有的消失或難以辨認(rèn)，染色質(zhì)聚集靠邊。葡萄籽原花青素干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較模型組改善，高劑量干預(yù)組改善尤為明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 4組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)減少；與模型組比較，葡萄籽原花青素干預(yù)組大鼠逃避潛伏期縮短，穿臺(tái)次數(shù)增加，且高劑量干預(yù)組變化更為顯著。

2.3 4組大鼠海馬區(qū)腦組織p-p38MAPK和IL-1β的表達(dá)見(jiàn)圖2、表2。與對(duì)照組比較，模型組海馬區(qū)腦組織p-p38MAPK和IL-1β蛋白表達(dá)水平增高；與模型組比較，葡萄籽原花青素干預(yù)組海馬區(qū)腦組織p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表達(dá)水平均降低，且高劑量干預(yù)組變化更為顯著。

圖1 4組大鼠海馬區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(電鏡，×20 000)

圖2 p-p38MAPK和IL-1β蛋白免疫印跡結(jié)果

表1 4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較(n=5)

組別逃避潛伏期/s2周6周穿臺(tái)次數(shù)2周6周對(duì)照組25．66±2．9725．40±3．0011．57±2．1810．94±2．40模型組62．15±7．44?68．42±7．91?4．42±1．25?2．87±0．92?低劑量干預(yù)組49．17±8．87?△56．47±6．98?△5．81±1．60?△6．32±1．12?△高劑量干預(yù)組32．76±2．02?△▲38．86±3．18?△▲7．68±1．61?△▲9．12±1．18?△▲F40．17036．42423．19126．250P<0．001<0．001<0．001<0．001

*:與對(duì)照組比較，P<0.05；△:與模型組比較，P<0.05；▲:與低劑量干預(yù)組比較，P<0.05。

表2 4組大鼠海馬區(qū)腦組織p-p38MAPK和IL-1β蛋白表達(dá)的比較(n=5)

*:與對(duì)照組比較，P<0.05；△:與模型組比較，P<0.05；▲:與低劑量干預(yù)組比較，P<0.05。

3 討論

OSAHS以反復(fù)發(fā)生的低氧/再?gòu)?fù)氧為特征，在此過(guò)程中，強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激以不同方式促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生[10-11]。p38MAPK是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控激酶，脂多糖、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1和缺血再灌注等炎性刺激均可介導(dǎo)p38MAPK的激活，其活化可介導(dǎo)炎癥因子如TNF-α、IL-1、核因子-κB(NF-κB)等生成增多，形成惡性循環(huán)[12]。IL-1β可通過(guò)NF-κB激活巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞分泌粘附因子、IL-6、IL-8等，是缺血缺氧后腦組織炎癥損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)[13]。

該研究結(jié)果顯示，慢性間歇性低氧模型大鼠海馬區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，同時(shí)腦組織p-p38MAPK和IL-1β的表達(dá)增加，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在間歇性低氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用；葡萄籽原花青素可減輕模型大鼠海馬區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)的損傷，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，抑制大鼠腦組織內(nèi)p38MAPK的活性和炎癥因子IL-1β的表達(dá)，且高劑量干預(yù)組表現(xiàn)更為顯著。葡萄籽原花青素是一種廣泛存在于各種植物中的天然抗氧化劑，其帶有的多電子羥基使電子在分子中較穩(wěn)定，兩個(gè)脂肪族羥基具有良好的水溶性，該分子結(jié)構(gòu)特征使其能夠阻斷自由基生成，有效清除超氧陰離子和羥基等自由基，清除能力與超氧化物歧化酶相當(dāng)；且葡萄籽原花青素對(duì)氧自由基的清除能力與劑量呈線性關(guān)系[14]。作者認(rèn)為，葡萄籽原花青素可抑制間歇性低氧大鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

國(guó)內(nèi)譚毓治等[15]曾報(bào)道葡萄籽原花青素能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和信息保持能力，這些作用與其能降低血液和腦組織中過(guò)氧化脂質(zhì)水平有關(guān)。作者認(rèn)為，葡萄籽原花青素可能通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)活化、減少IL-1β表達(dá)而改善間歇性低氧大鼠的認(rèn)知行為。研究[16-17]認(rèn)為p38MAPK信號(hào)的活化對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響主要表現(xiàn)為負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其活化后可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，亦可直接損傷海馬神經(jīng)突觸可塑性，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的受損，從而致空間學(xué)習(xí)能力受損。IL-1β可影響腦細(xì)胞對(duì)神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放和再攝取，調(diào)控輸入與輸出關(guān)系的反應(yīng)環(huán)路，影響突觸的可塑性。IL-1β異常升高時(shí)可抑制海馬部位神經(jīng)元的興奮性和突觸功能，減少海馬區(qū)有關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生成，間接抑制長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[16]。

總之,該研究結(jié)果表明，葡萄籽原花青素可以通過(guò)降低海馬區(qū)腦組織p38MAPK信號(hào)活化、減少IL-1β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善間歇性低氧導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷。葡萄籽原花青素具有多種藥理活性,其改善間歇性低氧致神經(jīng)損傷的其他機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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(2013-04-15 收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

Effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning memory capacity of rat model of chronic intermittent hypoxia

ZHAOYaning1，2)，CAOShuhua3),GUOXia2),WANGHongyang2)

1)TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300000 2)RehabilitationCollege,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000 3)EmergencyMedicineUnit,TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300000

intermittent hypoxia; p38MAPK; IL-1β; learning memory capacity; grape seed proanthocyanidin; rat

Aim: To investigate the effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning memory capacity of rat with chronic intermittent hypoxia. Methods: A total of 56 male SD rats were randomly allocated into four groups: control group, model group, low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups. Rats in control group were exposed in air，those in the other 3 groups suffered from intermittent hypoxia conditions for 6 weeks. 2 weeks before the hypoxia treatment, rats in low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups were began to intragastricly administrate grape seed proanthocyanidin at dose of 100 and 200 mg·kg-1, once per day,respectively. At the 2nd and 6th week of hypoxia treatment,neuron pathology in hippocampal region was observed using electron microscope,the expressions of phosphorylated p38MAPK and IL-1β proteins were detected by Western blot,and the learning memory capacity of rats were assessed by the Morris water maze. Results: Compared with those of control group, the microstructure of neuron was severely injured,the expressions of phosphorylated p38MAPK and IL-1β proteins significantly increased,and the escaping latency was prolonged,the frequency of crossing the platform decreased in the model group(P<0.05). Compared with those of the model group, neuron pathology changes significantly improved, phosphorylated p38MAPK and IL-1β expressions in brain tissue decreased, the escaping latency was shorter and the frequency of crossing the platform increased in the 2 grape seed proanthocyanidin groups(P<0.05),and the above mentioned changes in the high dose group were more significant(P<0.05). Conclusion: Grape seed proanthocyanidin could attenuate inflammation and improve learning memory capacity in rats with intermittent hypoxia.

*河北省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目 ZH2012046

R767

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.009