SYAP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)定位*

郝慧鑫，菅輝玲，朱美意，黃 瑾，羅 星#

1)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 石河子 832000 2)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診外科 石河子 832000

SYAP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)定位*

郝慧鑫1)，菅輝玲1)，朱美意2)，黃 瑾1)，羅 星1)#

1)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 石河子 832000 2)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診外科 石河子 832000

#通訊作者，男，1973年10月生，博士，副教授，研究方向：蛋白質(zhì)的功能與疾病，E-mail:Luoxingxing@126.com

突觸相關(guān)蛋白1；亞細(xì)胞定位；真核表達(dá)載體

目的：構(gòu)建pcDNA3.1(-)-Myc-突觸相關(guān)蛋白1(SYAP1)真核表達(dá)載體。方法合成SYAP1基因序列，加入Myc標(biāo)簽序列、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，并與線性化pcDNA3.1(-)連接，得重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1。重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、酶切及測序鑒定正確后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，采用Western blot和間接免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SYAP1蛋白的表達(dá)及定位情況。結(jié)果Myc-SYAP1成功插入pcDNA3.1(-)載體，SYAP1蛋白成功表達(dá)且定位于胞漿。結(jié)論pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1載體構(gòu)建成功。

各種神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變一直是困擾人類的一大類疾病,其預(yù)后主要取決于神經(jīng)受損后的再生修復(fù)能力。在眾多參與神經(jīng)發(fā)育分化的蛋白質(zhì)分子中，突觸相關(guān)蛋白(synapse-associated protein,SYAP)能促進(jìn)突起的生長，與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性密切相關(guān)[1]。SYAP1蛋白作為SYAP家族中的一員，對(duì)于提高受損神經(jīng)的修復(fù)能力，改善神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的生存質(zhì)量，具有非常好的應(yīng)用前景。研究[2]表明：除心臟、骨骼肌、脾臟和睪丸外，其他組織均能表達(dá)SYAP1，且SYAP1于腦組織中高表達(dá)，提示SYAP1在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。目前對(duì)SYAP1的研究大多集中在結(jié)構(gòu)分析方面，鮮見有關(guān)其功能的報(bào)道。作者旨在構(gòu)建SYAP1真核表達(dá)載體，為深入研究SYAP1蛋白在神經(jīng)再生與神經(jīng)系統(tǒng)可塑過程中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和細(xì)胞限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Myc單克隆抗體和β-actin單克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司)；DMEM培養(yǎng)基和抗鼠熒光二抗(Sigma公司)；PVDF膜(Whatman公司)。大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室保存；HEK293細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞研究所。

1.2目的基因的合成依據(jù)GenBank收錄的人SYAP1基因序列(登錄號(hào)：NM_032796.3)，全基因合成SYAP1序列[3-6]，并在5’端引入EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，3’端引入Myc(5’-CAAAAACTCATCTCAGAAGAG GATCTGTGA-3’)標(biāo)簽序列和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

1.3PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)SYAP1基因序列在靠近5’端設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物：上游5’-CCGCTCGAGACCTTAAGTCCGTCTTCACAC-3’，下游5’-ATTTGCGGCCGCTCAAGGCTCTTTTATGTC-3’，擴(kuò)增片段大小為280 bp，由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。

1.4重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的構(gòu)建目的基因片段經(jīng)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切、膠回收后，與雙酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)經(jīng)T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將PCR初步鑒定為陽性的菌落于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切進(jìn)行鑒定。PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.5細(xì)胞內(nèi)SYAP1蛋白表達(dá)的檢測應(yīng)用Western blot方法。采用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃溫箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。48 h后收取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉常溫封閉30 min，加入稀釋1 000倍的Myc一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4次，加入HRP標(biāo)記的二抗(按150 000稀釋)，常溫孵育30 min。TBST洗膜4次，ECL發(fā)光試劑盒顯影。以目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6SYAP1蛋白的細(xì)胞定位應(yīng)用間接免疫熒光分析方法。將HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，具體方案同1.5。轉(zhuǎn)染24 h后制備爬片，24 h后取出爬片，PBS洗滌，40 g/L多聚甲醛溶液固定，室溫靜置20 min。牛血清白蛋白室溫封閉30 min。用稀釋200倍的Myc一抗孵育，4 ℃過夜，PBS洗滌；加二抗于37 ℃避光孵育2 h，PBS洗滌；滴加緩沖甘油，覆以蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1重組質(zhì)粒的PCR鑒定陽性菌落經(jīng)PCR鑒定，可見到280 bp大小的片段，與預(yù)期目的片段的大小相符(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒的菌落PCR電泳圖

2.2重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的酶切鑒定對(duì)pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1進(jìn)行雙酶切，得到5 600 bp的載體片段和1 101 bp的目的片段，與預(yù)期相符(圖2)。測序結(jié)果證實(shí)插入正確。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切電泳圖

2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞SYAP1蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的HEK293細(xì)胞可見目的條帶(圖3)。

圖3 SYAP1蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

2.4SYAP1蛋白的細(xì)胞定位間接免疫熒光結(jié)果顯示SYAP1蛋白表達(dá)于胞漿(圖4)。

圖4 SYAP1蛋白的亞細(xì)胞定位(×400)

3 討論

突觸是神經(jīng)元之間傳遞電、化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其終末成分包含了完整的突觸前末梢、突觸后膜以及突觸后致密物，集中了全部的突觸相關(guān)蛋白，承擔(dān)著儲(chǔ)存、釋放、再提取神經(jīng)遞質(zhì)和維持突觸可塑性的重要作用[7]。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究[8]表明：突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)谏窠?jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用越來越明顯，尤其是在認(rèn)知功能損害中的作用。SYAP1蛋白對(duì)于突觸傳遞及其相關(guān)調(diào)節(jié)都極為重要，例如在Alzheimer病中突觸結(jié)構(gòu)、功能與神經(jīng)元的功能、活性有關(guān)，且突觸損傷的發(fā)生早于神經(jīng)元死亡丟失[9-10]。為了進(jìn)一步闡明神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)突觸傳遞和突觸可塑性的分子機(jī)制，SYAP1的研究正逐漸成為一個(gè)亮點(diǎn)。

課題組酵母雙雜交[11]結(jié)果顯示：SYAP1與神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin有相互作用，推測：Neuritin可能作為上游因子，通過與SYAP1相互作用，促進(jìn)突觸生長發(fā)育，維持神經(jīng)系統(tǒng)可塑性；也可能是作為SYAP1的正向調(diào)節(jié)因子或修飾分子，通過與SYAP1的相互作用，促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白向軸突終末轉(zhuǎn)運(yùn)，而產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。SYAP1在大多數(shù)成人的組織中能夠被檢測到，并且在人肝癌組織中表達(dá)下調(diào)。國內(nèi)未見針對(duì)SYAP1蛋白的更深入的相關(guān)功能和機(jī)制研究。SYAP1蛋白為一相對(duì)分子質(zhì)量40 000的蛋白，為了取得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者在C端帶了Myc標(biāo)簽序列，Myc蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為1100。此舉措將有助于將來的蛋白純化，同時(shí)防止表達(dá)產(chǎn)物的降解。此次重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1的成功構(gòu)建為后續(xù)SYAP1蛋白的功能研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(2013-06-21 收稿 責(zé)任編輯 李沛寰)

Construction of eukaryotic expression vector of SYAP1 and intracellular location

HAOHuixin1)，JIANHuiling1)，ZHUMeiyi2)，HUANGJin1)，LUOXing1)

1)DepartmentofBiochemistry,MedicalSchool，ShiheziUniversity,Shihezi832000 2)DepartmentofEmergencySurgery,theFirstAffiliatedHospital,ShiheziUniversity,Shihezi832000

synapse-associated protein 1;subcellular location;eukaryotic expression vector

Aim: To construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1. Methods: SYAP1 sequence was synthesized, joined with Myc-tag sequence andEcoR Ⅰ,Hind Ⅲ restriction sites, and then connected with linearized pcDNA3.1(-). After the identification by the results of colony PCR, restriction analysis and sequencing,the plasmid was transfected into HEK293 cells by lipid transfection, Western blot and indirect immunofluorescence were applied to observe the expression level and position of SYAP1 protein in cells. Results: The results of colony PCR, sequencing and restriction enzyme digestion showed that the target nucleotide sequences were successfully inserted into the expected sites of the vector. Western blot showed that SYAP1 protein was successfully expressed in transfected HEK293 cells,and lind indirect immunofluorescence result showed that SYAP1 protein located in cytoplasm. Conclusion: Recombinant vector of pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1 has been successfully constructed.

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 31160182；兵團(tuán)國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目 2011BC009

R651.3

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.006