大鼠彌漫性腦損傷后腦源性及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子時(shí)序性表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

陳梅花++++++陳貴珍++++++賈萬鈞++++++孫汝亮++++++胡丙杰

[摘要] 目的 探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）在大鼠腦組織中的表達(dá)水平隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律，以期為腦損傷時(shí)間的推斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 將90只無特定病原體（SPF）SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）及實(shí)驗(yàn)組（n=80），對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型，并根據(jù)傷后時(shí)間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組，每組各10只。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠腦組織中GDNF和BDNF表達(dá)，比較各組大鼠腦組織不同部位及損傷時(shí)間GDNF、BDNF的表達(dá)和變化規(guī)律。 結(jié)果 大腦、小腦、腦干組織中GDNF和BDNF陽性信號(hào)灰度在損傷后1 h組表達(dá)升高，6 h組達(dá)最高峰，12 h組開始回落；1、3、6、12、24、48、72、120 h組大腦、小腦、腦干組織中GDNF陽性信號(hào)灰度值均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.05），各組各部位陽性信號(hào)面積密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 BDNF、GDNF可以作為大鼠彌漫性腦損傷后經(jīng)過時(shí)間推斷的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；免疫組織化學(xué)；圖像分析

[中圖分類號(hào)] R651.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）07（a）-0017-04

顱腦損傷時(shí)間的推斷是法醫(yī)病理工作者一直致力解決的問題。目前尚未找到可應(yīng)用于法醫(yī)檢案的切實(shí)可行的生物學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用改良大鼠彌漫性腦損傷模型[1]，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析法探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived neuro trophic factor，GDNF）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在彌漫性腦損傷腦組織不同部位的表達(dá)水平隨損傷時(shí)間的變化規(guī)律及其相關(guān)性，以期為尋找腦損傷時(shí)間推斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)SD大鼠90只由中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK（粵）2007-2008]，雄雌不限，體重：（250±10）g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）及實(shí)驗(yàn)組（n=80），對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型，并根據(jù)傷后時(shí)間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

免疫組織化學(xué)試劑兔抗鼠GDNF一抗來自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology Inc公司；兔抗鼠BDNF一抗來自武漢博士德公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均來自福建麥新公司。病理圖像分析采用中山大學(xué)法醫(yī)系YC.TY-2050型法醫(yī)病理圖像分析系統(tǒng)，定量測(cè)量（灰度域0～256，0為白，放大倍數(shù)200×）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材及處理 參照本研究組前期改良大鼠彌漫性腦損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒1]的實(shí)驗(yàn)方法，并用本研究前期自制的打擊裝置對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠造成腦損傷。實(shí)驗(yàn)組按時(shí)間段分別用2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉斷頸取完整腦組織（圖1、2）；正常對(duì)照組大鼠麻醉后斷頸取腦。所有取材均用10%甲醛固定72 h，在大腦正中外側(cè)1～2 mm處作矢狀切面，同一切面取大腦、小腦、腦干3個(gè)部位，取材厚度約5 mm，石蠟包埋，切片厚度約2 μm，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 常規(guī)脫臘至水，采用高壓修復(fù)抗原的方法，蒸餾水沖洗3 min×2次；3%H2O2室溫處理20 min；PBS緩沖液沖洗3 min×3次；血清封閉37℃水浴10 min；加入一抗（1∶200工作濃度），4℃冰箱過夜；4℃冰箱取出室溫放置10 min后，37℃水浴20 min，PBS緩沖液洗5 min×3次；加入二抗，37℃水浴20 min，PBS緩沖液洗5 min×3次；加入鏈酶菌抗生素蛋白-辣根過氧化物酶復(fù)合物，37℃水浴20 min，PBS緩沖液洗5 min×3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3 圖像分析 每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，分別測(cè)量GDNF、BDNF陽性反應(yīng)物面積密度、灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果分析

腦組織損傷呈全腦局部彌漫性分布，有出血、神經(jīng)細(xì)胞腫脹、膠質(zhì)細(xì)胞嗜酸性變、腦組織疏松、神經(jīng)細(xì)胞變性壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象。在1、3 h 組出血改變較為明顯，其他改變沒有時(shí)間上的特異性分布。見圖3、4。

2.2 GDNF、BDNF免疫組化染色

GDNF、GDNF陽性結(jié)果為棕褐色，以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有染為棕褐色顆粒。正常對(duì)照組可見大腦、腦干、小腦分子層細(xì)胞有散在GDNF、BDNF弱陽性反應(yīng)，小腦浦肯野細(xì)胞有強(qiáng)陽性反應(yīng)，陽性信號(hào)主要位于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)各組陽性信號(hào)表達(dá)部位與正常對(duì)照組相同，陽性信號(hào)的面積密度無明顯變化，陽性著色明顯加深（圖5，封三）。

2.3 免疫組化染色結(jié)果分析

表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)圖像分析，測(cè)量陽性信號(hào)灰度值及面積密度值，做統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示：與正常對(duì)照組比較，1 h組GDNF信號(hào)灰度值開始增高（P < 0.05），3 h組表達(dá)增強(qiáng)到最高峰，12 h組有所回落，但仍高于正常對(duì)照組（P < 0.05），此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組。1、3、6、12、24、48、72、120 h組強(qiáng)度均顯著高于正常對(duì)照組水平（P < 0.05）；各組陽性信號(hào)面積密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

BDNF陽性信號(hào)灰度在損傷后1 h表達(dá)升高，6 h達(dá)最高峰，12 h開始回落，24 h回落到正常水平。各組陽性信號(hào)面積密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

GDNF對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)和修復(fù)的作用[2-4]，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)彌漫性腦損傷后GDNF表達(dá)水平上升，這種上升是機(jī)體對(duì)腦的保護(hù)性反應(yīng)[5]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦損傷后GDNF表達(dá)水平升高迅速且靈敏，在1 h即具有顯著性；GDNF在腦損傷表達(dá)水平增高呈現(xiàn)與時(shí)間變化相關(guān)規(guī)律，損傷1 h GDNF陽性表達(dá)開始增高，3 h表達(dá)增強(qiáng)到最高峰，12 h有所回落，但仍高于正常對(duì)照組，此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組，此外，大腦、小腦、腦干部位GDNF表達(dá)上調(diào)時(shí)間基本一致，符合腦損傷彌漫性分布的特點(diǎn)。

理論上，由于GDNF在神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)[6-7]，而腦損傷后兩種細(xì)胞的反應(yīng)程度和反應(yīng)時(shí)間不同[8]，本研究期望在腦損傷后GDNF表達(dá)變化趨勢(shì)圖出現(xiàn)兩個(gè)高峰：神經(jīng)細(xì)胞引起的GDNF表達(dá)高峰和膠質(zhì)細(xì)胞引起的GDNF的表達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)只觀察到在3 h的表達(dá)高峰，可能是因?yàn)槟z質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)一直持續(xù)到120 h后，使得GDNF二次表達(dá)高峰延續(xù)到120 h后，在本實(shí)驗(yàn)中由于受選取時(shí)間點(diǎn)限制，沒有反映這一規(guī)律；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)高峰出現(xiàn)在3 h，與王欣等[9]及陳寶友等[10]的研究結(jié)果不一致，這種不一致可能是損傷程度不同造成的。Wetmore等[11]的研究揭示神經(jīng)細(xì)胞有低水平BDNF mRNA表達(dá)，Sinson等[12]、Mocchetti等[13]及Wang等[14]分別在對(duì)缺血缺氧性腦損傷的研究中揭示BDNF對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用。董吉容等[15]報(bào)道大鼠液壓腦損傷后BDNF mRNA表達(dá)呈一定的時(shí)序變化。BDNF在局部彌漫性腦損傷后表達(dá)變化規(guī)律目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)這一問題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。綜合前人的研究結(jié)果，本研究選擇BDNF作為研究指標(biāo)具有下列理由：①選取指標(biāo)具特異性，在正常腦組織中有表達(dá)在腦損傷后表達(dá)水平特異性改變；②對(duì)腦損傷的反應(yīng)具有敏感性，損傷后短時(shí)間內(nèi)表達(dá)水平即有改變；③腦損傷后表達(dá)水平變化呈一定的規(guī)律。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠BDNF弱陽性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組BDNF蛋白表達(dá)水平呈明顯的時(shí)序性規(guī)律。由于本研究動(dòng)物模型腦損傷彌漫性分布的特點(diǎn)，對(duì)彌漫性腦損傷后大鼠腦組織不同部位BDNF表達(dá)情況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，大腦、小腦、腦干部位BDNF灰度值變化趨勢(shì)基本一致。本研究結(jié)果揭示BDNF在腦損傷后短期內(nèi)表達(dá)水平即有改變并且具有時(shí)序性規(guī)律，這種規(guī)律為將BDNF應(yīng)用到腦損傷時(shí)間推斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究的BDNF表達(dá)高峰出現(xiàn)在傷后6 h，與賈叢林等[16]報(bào)道的在傷后2 h表達(dá)高峰，以及與董吉容等[15]報(bào)道的在輕度和中度損傷組分別在2、4 h表達(dá)高峰不一致，這種不一致可能是由于損傷機(jī)制和程度不同造成的。本研究建立的腦損傷病死率低，損傷不嚴(yán)重，因而引發(fā)的機(jī)體自我保護(hù)程度輕。這與董吉容等[15]報(bào)道的BDNF表達(dá)水平與損傷程度呈正相關(guān)一致。但是由于腦損傷方式不一，在不同損傷機(jī)制下腦損傷程度分級(jí)不一，所以本實(shí)驗(yàn)的損傷程度與董吉容等[15]的損傷程度分級(jí)無可比性，因而表現(xiàn)在具體的表達(dá)水平變化趨勢(shì)上并不完全一致。與GDNF相比，BDNF表達(dá)水平在回到正常對(duì)照組水平前，各時(shí)間點(diǎn)上都有顯著性差異（P < 0.05），因此本研究認(rèn)為BDNF作為腦損傷推斷時(shí)間的指標(biāo)將會(huì)有更大的優(yōu)勢(shì)。

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（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：任 念）