麻仁潤腸丸、大黃和大黃素對大鼠大腸神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究

婁秀輝 黃光明 王楠 萬欣 葛欣 李景瑞

便秘是一種影響人類健康和生活質(zhì)量的常見疾病。據(jù)北京、西安、天津等地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)便秘的發(fā)生率可達6.07%～9.18%[1]。便秘的發(fā)病原因目前尚不十分清楚，但其中大多數(shù)患者為功能性疾患。對功能性便秘的治療應遵循個體化治療的原則，對于中、重度的便秘，短期或長期的藥物治療是主要的治療手段。我國傳統(tǒng)的中藥對功能性便秘的治療有著得天獨厚的優(yōu)勢，麻仁潤腸丸即是我國傳統(tǒng)復方中藥的一個代表。但是，關(guān)于麻仁潤腸丸的研究還停留在臨床經(jīng)驗方面，對麻仁潤腸丸的作用機理還沒有系統(tǒng)的研究，還有很多問題需要解決。有鑒于此，我們對比研究麻仁潤腸丸、大黃和大黃素瀉下作用的效果和副作用，并對麻仁潤腸丸的作用機制作一初步的探討，希望我們的研究可以為麻仁潤腸丸的臨床應用尋找理論上的依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：麻仁潤腸丸購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，大黃粉由本院自制，大黃素和MTT均購自美國Sigma公司，CHAT一抗購自美國Santa Cruz公司，nNOS和β-Tubulin一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，熒光標記的二抗購自Invitrogen公司，其他使用的試劑均為分析純。

2.藥物配制與給藥：麻仁潤腸丸組：將麻仁潤腸丸溶于5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC)配制成640 mg/ml的混懸液，按照3200 mg/kg/d灌胃給藥；大黃組：大黃粉溶于5% CMC配制成160 mg/ml的混懸液，按照800 mg/kg/d灌胃給藥；大黃素組：將大黃素用5% CMC配制成8 mg/ml的混懸液，按照40 mg/kg/d灌胃給藥。正常對照組給予相當體積的5% CMC。麻仁潤腸丸、大黃以及大黃素的用量參考人體用量和其它參考文獻。

3.動物飼養(yǎng)與分組：清潔級SD大鼠192只，購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院動物中心，雌雄不拘，8到10周齡，體重170～200 g。分組采用隨機數(shù)字表的方法。96只大鼠隨機分為正常對照組、麻仁潤腸丸組、大黃組和大黃素組，用于檢測大鼠一般狀況、腸道傳輸功能，其中每組12只動物用于7 d時大腸運動頻率和幅度檢測、每組另12只動物用于一般狀況和28 d時大腸運動頻率和幅度檢測。另96只大鼠隨機分為正常對照組、麻仁潤腸丸組、大黃組和大黃素組，其中每組12只動物于7 d時檢測腸壁組織、腸道傳輸功能、腸壁腸肌叢內(nèi)神經(jīng)的變化情況，每組另12只動物于28 d檢測上述指標。

二、方法

1.檢測大鼠一般狀況：目測各組大鼠皮毛色澤、活動度及精神狀態(tài)等的變化；檢測各組大鼠在實驗開始前1 d和實驗開始后1 d、4 d、7 d、14 d、28 d大便顆粒數(shù)和大便總重量；測量各組大鼠體重在上述時間點的變化。

2.檢測大鼠大腸腸壁組織在光學顯微鏡下的情況：檢測正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠在實驗7 d、28 d光鏡下黏膜層的厚度、絨毛高度、隱窩深度的改變；

腸道組織學觀察及評分：參照文獻[2]，各組動物在實驗7 d、28 d處死，分離結(jié)腸，自距肛門10 cm處沿長軸剖開結(jié)腸，冰生理鹽水反復沖洗腸腔，肉眼觀察大腸黏膜損傷程度，取腸組織一部分以40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后光學顯微鏡下觀察組織病理改變，并對大腸組織學損傷進行評分[3]：無明顯炎癥，腸壁黏膜組織和隱窩深度正常為0分；少量淋巴細胞浸潤(≤10%高倍視野)，腸壁并無結(jié)構(gòu)的改變?yōu)?分；中量淋巴細胞浸潤(10%～25%高倍視野)，隱窩稍變深，腸壁增厚，但未透過黏膜層，無潰瘍形成為2分；明顯淋巴細胞浸潤(25%～50%高倍視野)，血管密度增加，隱窩變深，腸壁增厚，透過黏膜層：3分；大量淋巴細胞浸潤(≥50%高倍視野)，血管密度增加，隱窩變深并扭曲，腸壁全層增厚，可見潰瘍形成為4分。

3.檢測大鼠腸道運動功能的情況：(1)分別在實驗7 d、28 d做墨汁推進實驗[4]，比較正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠腸道內(nèi)墨汁推進距離的差異。(2)分別在實驗7 d、28 d檢測大鼠的結(jié)腸肌電活動[5]，比較正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠結(jié)腸肌電活動的區(qū)別。

4.檢測大鼠腸壁腸肌叢內(nèi)神經(jīng)元的情況：Western Blot 法檢測正常對照、麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠在實驗7 d、28 d時腸肌叢內(nèi)的CHAT和nNOS蛋白表達，比較各組的差異。

三、統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)均以Means±SE表示，每個實驗至少重復三次。組間單變量統(tǒng)計分析采用one-way ANOVA法；組間兩個單獨變量統(tǒng)計分析采用Tukeyposthoc檢測以及two-way ANOVA法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、大鼠一般狀況的檢測結(jié)果

麻仁潤腸丸、大黃和大黃素組大鼠和對照組相比，在體重、大便總重和大便例數(shù)方面都有變化，麻仁組變化最輕(表1)。

二、大鼠大腸腸壁組織在光學顯微鏡下檢測結(jié)果

實驗7 d、28 d在光學顯微鏡下觀察大鼠大腸組織，其病理評分見表2。

三、大鼠腸道傳輸率的檢測結(jié)果

麻仁潤腸丸組大鼠于7 d、28 d腸道傳輸速率分別為77.1±4.6和75.4±4.2，均明顯快于正常對照組65.2±4.3和65.8±4.4(P<0.05)。大黃組大鼠于7 d腸道傳輸速率分別為78.3±4.8，也明顯快于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d腸道傳輸速率分別為68.7±3.5，明顯快于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于麻仁潤腸丸組(P<0.05)。大黃素組大鼠于7 d腸道傳輸速率分別為78.7±5.0，明顯快于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d腸道傳輸速率分別為67.2±3.1，明顯快于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于麻仁潤腸丸組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠腸道傳輸速率(Means±SE)

表4 各組大鼠結(jié)腸慢波頻率與振幅(Means±SE)

四、大鼠的結(jié)腸慢波頻率與振幅的檢測結(jié)果

麻仁潤腸丸組大鼠于7 d、28 d的結(jié)腸慢波頻率與振幅分別為17.23±1.76與0.57±0.08、16.87±1.76與0.56±0.08，均明顯快于和高于正常對照組的11.76±1.89與0.45±0.10、11.38±1.87與0.44±0.11(P<0.05)。大黃組大鼠于7 d的結(jié)腸慢波頻率與振幅分別為18.01±1.65與0.58±0.08，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較無明顯變化；于28 d的結(jié)腸慢波頻率與振幅分別為13.54±1.85與0.52±0.08，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組(P<0.05)。大黃素組大鼠于7 d的結(jié)腸慢波頻率與振幅分別為18.54±1.83與0.59±0.07，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦無明顯變化；于28 d的結(jié)腸慢波頻率與振幅分別為13.24±1.21與0.51±0.07，明顯快于和高于正常對照組(P<0.05)，明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組(P<0.05，表4)。

五、大鼠腸壁腸肌叢內(nèi)CHAT和nNOS蛋白表達量的變化

在于實驗7 d、28 d通過Western Blot法檢測四組大鼠腸肌叢內(nèi)的CHAT和nNOS蛋白表達。

1.CHAT蛋白檢測結(jié)果顯示：麻仁潤腸丸組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的1.11、0.95倍，與正常對照組比較無明顯變化；大黃組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的1.73、0.72倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05)；大黃素組于7 d、28 d的CHAT蛋白含量分別是正常對照組的2.24、0.61倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05，圖1)。

注：C為正常對照組；M為麻仁潤腸丸組；R為大黃組；E為大黃素組，*代表與對照組比較P<0.05，#代表與麻仁潤腸丸組比較P<0.05

2.nNOS蛋白檢測結(jié)果顯示：麻仁潤腸丸組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.94、1.13倍，與正常對照組比較無明顯變化；大黃組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.83、1.75倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05)；大黃素組于7 d、28 d的nNOS蛋白含量分別是正常對照組的0.64、2.32倍，與正常對照組比較均有明顯變化(P<0.05)，與麻仁潤腸丸組比較亦均有明顯變化(P<0.05，圖2)。

注：(n=3，means±SE，*代表與對照組比較P<0.05，#代表與麻仁潤腸丸組比較P<0.05)

討 論

便秘是一種影響人類健康和生活質(zhì)量的常見疾病。在發(fā)達國家便秘的發(fā)生率占人群的10%～15%左右。

瀉劑結(jié)腸是指長期大劑量服用刺激性瀉劑而致結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)失調(diào)和相應功能紊亂，導致腸動力障礙，對瀉劑反應性明顯下降，使患者對瀉劑產(chǎn)生依賴的一種狀況，是慢傳輸性便秘(slow transit constipation,STC)的一種重要臨床類型[6]。

在本實驗中，我們首先觀察了各給藥組大鼠的一般狀況和腸壁組織病理狀況。結(jié)果顯示，麻仁潤腸丸長期給藥后瀉下作用可穩(wěn)定保持、對腸壁組織影響較小，而大黃和大黃素組長期給藥后瀉下作用減弱、對腸壁組織影響較大，主要表現(xiàn)在大便顆粒數(shù)和大便總重量于實驗后期增多和增重的幅度明顯小于麻仁潤腸丸組；動物體重明顯減輕；腸壁組織病變情況明顯加重。說明長期給藥后麻仁潤腸丸的瀉下作用優(yōu)于大黃、大黃素；對腸壁組織的損傷小于大黃和大黃素。

1943年，Heibrun[7]研究了27例長期服用瀉劑的便秘病人，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸袋狀收縮消失、腸腔擴張，黏膜萎縮，黏膜下層有單核細胞浸潤和脂肪沉積，并首次提出了“瀉劑結(jié)腸”的觀點。近年的研究借助放射免疫分析、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)“瀉劑結(jié)腸”ENS的多種神經(jīng)遞質(zhì)含量或分布異常，其特征與STC結(jié)腸的變化相似，大鼠“瀉劑結(jié)腸”腸道傳輸減慢也符合STC的特點，說明接觸性瀉劑在STC的發(fā)生發(fā)展中有促進作用[8]。結(jié)腸的肌電活動有3種表現(xiàn)形式:(1)電控制活動(electrical control activity,ECA)，又稱慢波或基本電節(jié)律。(2)電振蕩活動(electrical oscillatory activity,EOA)。(3)電反應活動(electrical response activity,ERA)，又稱峰電位或動作電位。動作電位產(chǎn)生于慢波之上，與平滑肌收縮相一致，是推進性運動的主要動力。慢波是相對規(guī)律的一種周期性電活動，控制腸道收縮的節(jié)律，無論收縮與否始終存在[9]。有研究表明大劑量應用刺激性瀉劑可影響結(jié)腸慢波的產(chǎn)生和傳導。其頻率異常會導致腸道的推進性收縮頻率減慢或收縮不協(xié)調(diào)，其振幅降低會導致結(jié)腸收縮力下降，結(jié)果表現(xiàn)為結(jié)腸運動無力，腸道傳輸功能遲緩。

在本實驗中，我們于7 d、28 d檢測了大鼠腸道傳輸速率和結(jié)腸慢波頻率與振幅。結(jié)果顯示，麻仁潤腸丸長期給藥后對大鼠腸道傳輸速率和結(jié)腸慢波頻率與振幅影響可穩(wěn)定保持，而大黃和大黃素組長期給藥后對大鼠腸道傳輸速率和結(jié)腸慢波頻率與振幅影響變化較大，主要表現(xiàn)在給藥后期大鼠的腸道傳輸速率明顯慢于麻仁潤腸丸組；大鼠結(jié)腸慢波頻率與振幅明顯慢于和低于麻仁潤腸丸組。說明長期給藥后麻仁潤腸丸對大鼠腸道傳輸速率和結(jié)腸慢波頻率與振幅的影響優(yōu)于大黃和大黃素組。

胃腸運動由交感、副交感神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)和Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)組成的腸神經(jīng)細胞網(wǎng)絡(luò)控制[10-12]。腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)多達數(shù)十種，其中興奮性遞質(zhì)主要包括乙酰膽堿(AchE)、P物質(zhì)(SP)等；抑制性遞質(zhì)以非腎上腺素非膽堿能神經(jīng)(NANC)遞質(zhì)為主，包括一氧化氮(NO)、血管活性腸肽(VIP)、生長抑素(SOM)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、三磷酸腺苷(ATP)等[13]。在結(jié)腸腸運動神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)中Ach和NO分別是興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的兩個典型代表[14-15]。AchE是重要的興奮性運動神經(jīng)遞質(zhì)，能使胃腸道平滑肌去極化，促進胃腸蠕動收縮。研究表明，大鼠回腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)膽堿能神經(jīng)減少能夠引起興奮性遞質(zhì)減少，腸蠕動減慢，胃腸傳輸速率延遲[16-17]。另外，Ach使平滑肌細胞膜去極化，刺激腸道壁內(nèi)膽堿能神經(jīng)產(chǎn)生興奮性接頭電位(EJPs)，引起平滑肌收縮。NO是以L-精氨酸為底物，在還原性輔酶Ⅱ等因子輔助下由NO合成酶(NOS)催化生成。NOS包括三種亞型：神經(jīng)型NOS(neuronal NOS,nNOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)和誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)。前兩者合稱為結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive NOS,cNOS)。研究發(fā)現(xiàn)nNOS主要分布于大鼠結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元，定位于細胞質(zhì)。當NANC能神經(jīng)受到刺激時，即釋放NO并迅速彌散至平滑肌，使其第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量增多，使胞漿Ca2+外流并抑制Ca2+內(nèi)流，致使胞漿游離Ca2+濃度降低，從而抑制肌動蛋白與肌球蛋白的結(jié)合，導致平滑肌舒張，胃腸運動減弱。另外，NO使平滑肌細胞膜超極化，產(chǎn)生抑制性接頭電位(IJPs)，而IJPs能破壞或減少環(huán)肌和縱肌自發(fā)性電節(jié)律性活動，降低慢波波幅值。此外，NO也可同其他神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽相互協(xié)調(diào)，共同影響腸的生理功能。有報道成人功能性便秘患者結(jié)腸黏膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢NO陽性神經(jīng)元數(shù)量和密度均較正常組明顯增多、增強、黏膜內(nèi)NO生成量增加[18-19]。

以上實驗結(jié)果顯示，麻仁潤腸丸瀉下作用溫和、長期應用治療效果優(yōu)于大黃、大黃素，而其副作用卻低于大黃、大黃素，長期應用不會出現(xiàn)嚴重的毒副反應，適合便秘老年患者長期應用。

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