冠狀靜脈逆行灌注堿性成纖維細胞生長因子對骨髓間充質干細胞向心肌內歸巢的影響

李學強 王曉 甄雷 繆黃泰 吳星欣 任紅梅 師樹田 喬巖 劉新民 闕斌 聶紹平

基礎研究

冠狀靜脈逆行灌注堿性成纖維細胞生長因子對骨髓間充質干細胞向心肌內歸巢的影響

李學強 王曉 甄雷 繆黃泰 吳星欣 任紅梅 師樹田 喬巖 劉新民 闕斌 聶紹平

目的 探討經冠狀靜脈逆行灌注堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對骨髓間充質干細胞（MSCs）心肌內歸巢的影響。方法 雜種犬12只，體重20～25（22.4±1.8）kg，采用開胸結扎法建立急性心肌梗死模型。1周后將存活犬（n=11）隨機分為MSCs組（n=5）和bFGF+MSCs組（n=6）。采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法在體外分離、培養(yǎng)MSCs，移植前對MSCs進行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育標記。逆行灌注實驗后1周，免疫熒光法比較兩組梗死心肌內DAPI陽性細胞數，評價逆行灌注bFGF對MSCs歸巢的影響。結果 采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法成功分離并富集MSCs，77.19%以上的細胞都處于G0/G1期，強表達CD44，陽性率為95.8%；MSCs體外DAPI標記率高，初始標記率達99.6%。免疫熒光顯示，bFGF+MSCs組DAPI陽性細胞數明顯高于 MSCs組［（325±106）/mm2比（186±67）/mm2，P＜0.05］，聯合組 MSCs分布更為均勻；部分MSCs與心肌細胞共定位。結論 經冠狀靜脈逆行灌注bFGF能更有效地促進MSCs歸巢至梗死心?。煌瑫r，MSCs在心肌內的分布也更為均勻。

細胞移植；堿性成纖維細胞生長因子；骨髓間充質干細胞；冠狀靜脈逆行灌注；歸巢

大量研究顯示，心臟細胞移植是修復壞死心肌的有效方法。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）具有易分離培養(yǎng)、多系分化增殖、無免疫排斥等優(yōu)點，成為理想的移植細胞[1,2]。然而，無論采用何種移植途徑，MSCs在心肌內歸巢和分化的比例均較低[3]。體外研究顯示，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）能促進MSCs遷移和增殖[4,5]，但在體環(huán)境下是否存在該效應仍不明確。另外，我們前期采用選擇性冠狀靜脈逆行灌注途徑建立了冠狀靜脈血液與梗死心肌之間的bFGF濃度梯度[6,7]。因此，本研究采用犬急性心肌梗死模型，評價冠狀動脈逆行灌注bFGF對MSCs歸巢的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雜種犬12只，體重20～25（22.4±1.8）kg，犬齡 1～2 歲，購自北京來福實驗動物養(yǎng)殖場。實驗中對動物的處置符合相關動物倫理學要求。

1.2 MSCs體外分離、培養(yǎng) 選擇髂后上棘為穿刺點行骨髓穿刺術，抽取犬骨髓約10 ml。采用密度梯度離心法從骨髓中分離MSCs。細胞分離成功后，加入含10%胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）的低糖DMEM（美國Hyclone公司）完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行體外擴增。細胞生長到80%融合時進行1∶3傳代。倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復上述操作，反復傳代擴增。收獲細胞后重懸成單細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）調節(jié)濃度為1×107/ml備用。

1.3 繪制MSCs的生長曲線 取生長狀態(tài)良好的第1、3、5代細胞，以0.25%胰酶+0.03%EDTA消化，制成細胞懸液。以1×104/皿的密度接種于6孔板內，每天各取2孔進行細胞記數，取均值，剩余細胞每3天換液一次，最后根據細胞計數結果以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4 檢測MSCs的生長周期 取生長狀態(tài)良好的第2代細胞，0.25%胰酶室溫消化后制成細胞懸液，4℃預冷的無水乙醇固定30 min，1200 r/min離心5 min，去除上清，預冷的 PBS漂洗 2次，20 μg/ml RNA酶37℃水浴30 min，加入50 μg/ml的碘化丙啶，4℃避光染色15 min，流式細胞儀檢測并分析。

1.5 分析MSCs的細胞表型 取培養(yǎng)第2代末細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止反應，吹打制成細胞懸液；用PBS制成300 μl含有 2.5×106個 MSCs的單細胞懸液；將細胞懸液分裝至6只流式管中，分別加入5 μl羊血清封閉30 min；6個流式管中分別加入CD44-異硫氰 酸 熒 光 素 （FITC）、CD14-FITC、CD34-FITC、CD11b-藻紅蛋白（PE）、HLA-DR-PE及對照PBS各 5 μl，混勻，反應 30 min；PBS 洗去未標記上的抗體。每管再加入300 μl PBS重新混懸細胞，流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD14、CD34、CD44、CD11b和HLA-DR的表達。流式抗體均購自美國eBioscience公司。

1.6 急性心梗模型的建立 靜脈全身麻醉（3%戊巴比妥鈉，1 ml/kg），術中維持麻醉追加戊巴比妥劑量為首次劑量的20%。建立靜脈通路，經口氣管內插管，呼吸機輔助通氣（呼吸頻率15～20次/min，潮氣量10 ml/kg），心電監(jiān)護。犬采用右側臥位，備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿左側第4～5肋間做切口，切開皮膚、皮下組織，進入胸腔后，切開心包并懸吊，充分暴露左心室，分離左前降支（LAD）中段主要對角支遠段1 cm處并結扎。記錄結扎前后的心電圖?？梢娊Y扎部位以下及心尖部心肌顏色變暗，搏動減弱。模型制作成功后，逐層縫合，關胸、鼓肺。待動物自主呼吸完全恢復后拔除氣管插管，停用呼吸機，觀察心率、血壓、呼吸平穩(wěn)后送回動物房。術后3 d常規(guī)應用抗生素，預防感染。

1.7 MSCs體外DAPI標記與檢測 體外分離、培養(yǎng)的MSCs，當細胞總數培養(yǎng)擴增至1×107后，在移植前加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Sigma公司）進行體外孵育標記。具體步驟如下：①收獲細胞，用1∶1的0.25%的胰蛋白酶和0.03%EDTA混合液消化，用含血清培養(yǎng)基終止，洗滌、離心；②用1 ml含血清的培養(yǎng)基重懸細胞、計數；③取 50 μl的無菌 DAPI溶液（1 μg/μl）加入細胞重懸液中（終濃度為50 μg/ml），混勻；④置37℃孵箱染色 30 min；⑤PBS 離心洗滌（1200 r/min，5 min）6次，以去掉多余的DAPI；⑥收集細胞：平均每只犬心臟大約注入1×107個細胞，用2 ml無血清培養(yǎng)基重懸，冰上保存少于1 h植入心肌。

DAPI標記MSCs的培養(yǎng)瓶用錫紙包裹，避光換液。于標記后當日在熒光鏡下觀察。計數視野中DAPI陽性細胞，同視野相差鏡下計數視野中全部細胞，按標記率=DAPI陽性細胞數/全部細胞數，計算初始標記率。

1.8 冠狀靜脈逆行灌注 灌注前共11只動物存活，將存活動物進行編號，隨機分為MSCs組（n=5）和bFGF+MSCs組（n=6）。根據體外實驗結果，選擇bFGF灌注液的濃度為200 ng/ml，每只犬MSCs（DAPI標記）細胞總量為1×107。各組灌注液的制備方法具體如下：① MSCs組：生理鹽水（NS）和MSCs細胞懸液各20 ml；②bFGF+MSCs組：bFGF灌注液和 MSCs細胞懸液各 20 ml。bFGF購自美國PeproTech公司。

心梗模型制作1周后行冠狀靜脈逆行灌注實驗?？紤]到bFGF+MSCs組需要分兩步先后灌注bFGF和MSCs（經冠狀靜脈灌注bFGF后在冠狀靜脈與心肌組織之間形成bFGF濃度梯度，從而促進隨后灌注的MSCs向心肌歸巢），為減少組間差異，對MSCs組首先灌注NS，然后灌注MSCs。采用OTW球囊灌注到與LAD平行的前室間靜脈，保持球囊充盈10 min。

1.9 MSCs的在體歸巢評價 逆行灌注實驗后1周處死動物，迅速取出心臟，冷生理鹽水沖洗干凈，取移植部位心肌組織10塊，OCT包裹液氮冷凍，連續(xù)冰凍切片（5 μm）。4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS 5 min×3次；羊血清室溫封閉10 min；傾去血清，滴加50 μl鼠抗α-sarcomeric antinin單克隆抗體（1∶800稀釋，美國Sigma公司），濕盒中4℃過夜（16～24 h）；次日拿出濕盒，棄一抗，PBS 5 min×3次；滴加羅丹明標記的山羊抗鼠IgG（1∶50稀釋，美國 KPL公司），37℃孵育 30 min；棄二抗，PBS 5 min×3次；熒光封片液封片。

每個組織塊選擇1張切片，熒光顯微鏡（400×視野）觀察DAPI陽性細胞分布并計數，Image-Pro Plus5.1軟件分析。每張切片隨機選擇5個視野存盤，5個視野的平均數作為每張切片的測值。比較兩組梗死心肌內DAPI陽性細胞數，評價bFGF對MSCs歸巢的影響。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用±s表示，組間比較采用非配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物臨床觀察 本實驗過程中，有1只犬于心梗模型制作成功后3 d因傷口感染死亡，其它犬存活情況良好。共11只犬接受冠狀靜脈逆行灌注實驗，術中及術后無低血壓、心律失常等并發(fā)癥發(fā)生。

2.2 MSCs形態(tài)學觀察和生長特性

2.2.1 形態(tài)學觀察 原代細胞剛接種時呈圓形，細胞核位于中央，折光性強，懸浮于培養(yǎng)液中。12 h可見少量貼壁細胞，同時培養(yǎng)液中混有血細胞等非貼壁細胞（圖1A）；24 h首次換液，貼壁細胞明顯增加，開始呈三角形、多角形、梭形，形成3～10個細胞的細胞團。培養(yǎng)2～3 d，細胞呈局部集落式生長，細胞形態(tài)伸展為長梭形（圖1B）；培養(yǎng)5～6 d，原來的單個細胞或細胞集落形成多個細胞克隆，以后相差顯微鏡觀察可見各個細胞克隆進一步擴大，呈旋渦狀或水草樣；7～9 d后細胞鋪滿皿底80%～90%，細胞緊密貼附，可以傳代（圖1C）。

圖1 MSCs培養(yǎng)過程的形態(tài)學觀察和增殖情況

2.2.2 生長曲線 以橫軸作為時間，縱軸為細胞增殖量繪制傳代細胞（P1、P3、P5）生長曲線（圖 2）。生長曲線顯示：各代細胞生長曲線大致相同，呈“S”形，潛伏期為1～2 d。體外培養(yǎng)72～96 h后，細胞達對數生長期，6～7 d細胞接近融合，增殖進入平臺期。傳代細胞與原代細胞差別不明顯。

圖2 MSCs體外培養(yǎng)生長曲線

2.3 細胞周期及表型鑒定

2.3.1 細胞周期 使用流式細胞儀對第2代末的MSCs進行細胞周期分析，77.19%以上的細胞都處于G0/G1期（圖3），說明其大部分保持未分化狀態(tài)，具有較高增殖潛能。

圖3 P2細胞周期檢測結果

2.3.2 細胞表型鑒定 流式細胞儀檢測MSCs的表面抗原特性。第2代末的細胞不表達CD14（單核/巨噬細胞表面標志）、CD34和CD11b（造血干細胞表面標志），HLA-DR（成纖維細胞表面標志），強表達CD44（黏附分子），陽性率為95.8%，故其純度較高（圖4）。

圖4 P2細胞表型檢測結果

2.4 DAPI標記的MSCs體外初始標記率檢測結果熒光顯微鏡下，DAPI標記的MSCs胞核可見明顯藍色熒光，初始標記率達99.6%（圖5）。

圖5 MSCs體外DAPI標記圖像 A：×40，B:×400

2.5 DAPI標記的MSCs在體歸巢評價 35.4%的切片可以看到DAPI標記的MSCs陽性細胞。bFGF+MSCs組DAPI陽性細胞數明顯高于 MSCs組［（325±106）/mm2比 （186±67）/mm2，P＜0.05］（圖6）。熒光顯像示聯合治療組有更多的細胞歸巢到缺血心肌，聯合組MSCs分布更為均勻；部分MSCs與心肌細胞共定位（圖7）。

圖6 兩組梗死區(qū)DAPI陽性細胞密度（P＜0.05）

圖7 兩組DAPI標記的MSCs在體歸巢情況

3 討論

隨著干細胞技術和組織工程學研究的不斷深入，骨髓干細胞移植逐漸成為缺血性心臟病及終末期心力衰竭治療的理想選擇。多項實驗研究顯示，骨髓干細胞分化為心肌樣細胞、旁分泌作用以及募集內源性干細胞是其修復壞死心肌及改善心臟功能的主要機制[1,8,9]。MSCs為多能干細胞，具有易分離培養(yǎng)、多系分化增殖、無免疫排斥等優(yōu)點。在可供移植的干細胞群中，MSCs分化為心肌細胞的可能性最大[1,2]，因而理應成為組織工程中理想的種子細胞。然而，在移植途徑的選擇以及在體歸巢和存活等方面還存在許多亟待解決的實際問題。

3.1 細胞移植的途徑 MSCs移植的主要途徑包括直接心肌內注射（包括心臟直視下注射和經導管介入注射）、經冠狀動脈灌注和經靜脈注射等。研究顯示，靜脈注射MSCs后細胞難以歸巢到心肌，而歸巢到非心臟組織可引起遠隔器官無必要的血管新生，導致血管瘤、視網膜血管增生等并發(fā)癥。冠脈內注射能將移植細胞選擇性地注入靶心肌區(qū)域。研究顯示，該方法能明顯提高患者運動能力以及左室射血分數，改善心肌的灌注。經冠脈灌注MSCs后細胞也難以大量歸巢到缺血心肌，在冠狀動脈完全閉塞時也無法實施，且可導致心肌微梗死灶，存在致動脈粥樣硬化的風險[10,11]。心肌內注射盡管可將大量MSCs導入心肌，但由于其分布不均勻，且形成與自身心肌分隔的“小島（islets）”，移植細胞難以長期存活，不易與自身心肌形成耦聯，并可導致心律失常與心肌壞死[12]。近幾年的研究顯示，冠狀靜脈逆行灌注有望成為缺血性心臟病細胞移植的新途徑[10,13,14]。

初步研究發(fā)現，冠狀靜脈逆行灌注用于細胞移植安全可行。Suzuki等[15]在結扎鼠冠狀動脈后，經導管向心左靜脈灌注表達β-半乳糖苷酶的骨骼肌前體細胞（skeletal muscle precursor cells）。原位染色顯示，左心室游離壁全層均有β-半乳糖苷酶表達。28 d后，在梗死邊緣區(qū)有大量染色陽性的多核肌管（multinuclear myotubes）。超聲心動圖研究發(fā)現，試驗組心功能與心室腔徑改善情況均優(yōu)于假手術鹽水灌注對照組。Yokoyama等[16]在豬心肌梗死6 h和2周后分別經AIV灌注骨髓單個核細胞。結果顯示，細胞可在梗死心肌全層分布，移植組梗死區(qū)血管新生和側支重構明顯。我們前期也證實，采用OTW球囊經冠狀靜脈逆行灌注MSCs安全可行，靶向性高[7]。理論上，與心肌內注射相比，冠狀靜脈逆行灌注具有創(chuàng)傷小、安全性高等優(yōu)點，且干細胞能在缺血心肌全層均勻分布，有利于移植細胞的歸巢、分化與長期存活；與冠脈途徑相比，冠狀靜脈逆行灌注途徑的靶向性和安全性較高，可長時間或多次灌注，更有利于移植細胞均勻持久地歸巢到缺血心肌。

最近，Baklanov等[17]比較了經皮心肌內注射或經冠狀靜脈逆行灌注“微粒”在心肌內的分布情況。結果兩種方式歸巢至心肌內的“微粒”數量相當，前者主要分布在心尖部，后者在心室中部和前間隔分布較多。本課題經冠狀靜脈依次灌注bFGF和MSCs后發(fā)現，歸巢到梗死區(qū)心肌的MSCs明顯增多，且分布更為均勻，可能與bFGF濃度梯度更有效地促進MSCs歸巢有關。

3.2 在體bFGF濃度梯度對MSCs歸巢的影響研究顯示，人體存在自身動員機制，能將骨髓干細胞轉移至受損心臟，并可能參與心肌自身修復[18]。然而，由于歸巢至心肌的干細胞數量較少，其作用也難以持久，因而心臟修復作用十分有限[19]。近年來多項研究顯示，將自體骨髓干細胞導入受損心肌后，心臟功能有一定程度的改善[20]。然而，如何將干細胞均勻持續(xù)地導入受損心肌還有待進一步探討。

體外研究顯示，MSCs動員及向受損組織歸巢依賴于系統(tǒng)和局部的炎癥狀態(tài)[21]，許多生長因子都能夠調控MSCs的遷移與增殖[22]。利用Boyden chamber體外遷移體系觀察bFGF等對MSCs遷移的影響發(fā)現，當存在bFGF梯度時，肌絲呈現出與梯度強烈相關的平行排列，bFGF在MSCs的移行中起著吸引和路由作用。隨著bFGF濃度增加，MSCs的移行活力也逐漸增強[5]。最近Barkefors等[23]利用微流體趨化小室體系評價bFGF梯度對內皮細胞遷移的影響。結果發(fā)現，在0～50 ng/ml的梯度范圍內，bFGF對內皮細胞趨化效應最強。在濃度梯度的上限（50 ng/ml），細胞遷移活力明顯下降。我們前期首次在在體環(huán)境下建立了冠狀靜脈血液與梗死心肌之間的bFGF濃度梯度[6]。與單純MSCs移植相比，在bFGF濃度梯度的時間窗內（球囊充盈5～10 min）進一步灌注MSCs能更有效地促進其歸巢至壞死心??；同時，我們選擇的冠狀靜脈逆行灌注途徑靶向性更高、作用更持久，利于在局部形成穩(wěn)定的bFGF濃度梯度，促進MSCs向梗死心肌富集，充分發(fā)揮心臟修復作用。

經冠狀靜脈逆行灌注是MSCs移植的理想途徑。采用該途徑灌注bFGF所形成的濃度梯度，能更有效地促進MSCs歸巢至梗死心??；同時，MSCs在心肌內的分布也更為均勻。

（本文圖片見P287-288頁）

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Basic fibroblast growth factor improves bone marrow mesenchymal stem cells homing to myocardium byretrograde coronary venous perfusion

LI Xue-qiang＊，WANG Xiao，ZHEN Lei，et al.＊Emergency&Critical Care Center，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing Institute of Heart,Lung and Blood Vessel Diseases，Beijing 100029，China

NIE Shao-ping，E-mail：spnie@126.com

Objective To evaluate the effects ofbasic fibroblast growth factor（bFGF）on mesenchymal stem cell（MSCs）homing into myocardium byretrograde coronary venous perfusion.MethodsAcute myocardial infarction was induced by ligation of left anterior descending coronary artery in 12 dogs［20-25（22.4±1.8）kg］.One week later，the survival dogs（n=11）were randomly divided into MSCs group（n=5） and bFGF+MSCs group（n=6）.MSCs were isolated by density gradient centrifugation，expanded in vitro，and labeled with 4’，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）before being injection.One week after perfusion，the number of DAPI-positive cells was compared between the two groups by immunofluorescence method.Results MSCs were successfully isolated and cultured.77.19%of the totals were at G0/G1，and 95.8%was positive for CD44.DAPI labeling rate was 99.6%in vitro.DAPI-positive MSCs were significantly more in the bFGF+MSCs group than in the MSCs group by immunofluorescence imaging［（325±106）/mm2vs（186±67）/mm2，P＜0.05］.MSCs distributed more homogenous in the com－bination group，some cellscolocalized with host cardiomyocytes.Conclusion Coronary venous retrograde perfusion of basic fibroblast growth factor can improve MSCs homing to myocardium，and MSCs distributed more homogenous in the myocardium.

Cell transplantation； Basic fibroblast growth factor； Bone marrow mesenchymal stem cells；Coronary venous retroperfusion；Homing

國家自然科學基金面上項目（項目編號：81070166和81270284）

100029 北京市，首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院急診危重癥中心，北京市心肺血管疾病研究所（李學強、王曉、甄雷、繆黃泰、吳星欣、任紅梅、師樹田、闕斌、聶紹平），心內科（喬巖、劉新民）；中國航天科工集團七三一醫(yī)院心內科（李學強）

聶紹平，E-mail：spnie@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.03.019

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2014）03-0253－05

2014-01-06）