乳酸球菌RL—68生產菌株工業(yè)培養(yǎng)基優(yōu)化工藝研究

孫傳伯　曹佩佩　楊有蘭等

摘要：將工業(yè)生產產生的副產品餅干渣加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過單因素和正交試驗對乳酸球菌RL-68生產菌種工業(yè)培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定發(fā)酵優(yōu)化條件為：餅干渣105 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7，在培養(yǎng)溫度35 ℃、發(fā)酵初始pH值6.5～6.8條件下培養(yǎng)，這時乳酸球菌RL-68活菌數(shù)最高，可達7.32×109 CFU/mL。

關鍵詞：乳酸球菌；工業(yè)培養(yǎng)基；優(yōu)化；配方；發(fā)酵工藝；正交試驗

中圖分類號： TQ920.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0285-03

收稿日期：2013-10-14

基金項目：國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（編號：201210376003、201310376006）；皖西學院研究性學習項目（編號：wxxyx2013062、wxxyx2013074）；安徽省高校自然科學基金（編號：KJ2011B216）。

作者簡介：孫傳伯（1978—），男，安徽桐城人，碩士，講師，研究方向為生物質能工程。E-mail：scb19781979@126.com。乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產生乳酸的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌[1-5]。乳酸菌是一群相當龐雜的細菌，目前至少可分為18個屬，共有200多種，除極少數(shù)外，絕大部分都是人體內必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。目前，已被國內外生物學家所證實，腸內乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關系。乳酸球菌是乳酸菌的一種，是工業(yè)上尤其是食品工業(yè)上的常用菌種，存在于乳制品、發(fā)酵植物食品（如泡菜、酸菜）、青貯飼料及人的腸道尤其是乳兒腸道中，具有發(fā)酵溫度高、產酸率相對較高、對糖利用率高、發(fā)酵時不需通氧氣等優(yōu)點，在工業(yè)生產上具有非常廣闊的應用前景。目前，世界上對于生產乳酸球菌的培養(yǎng)基有很多研究，但使用的多是實驗室試劑，成本較大。本試驗運用工業(yè)生產產生的副產品餅干渣和玉米漿來代替生產乳酸球菌的碳源和氮源，探索簡單、低成本、高產量的適用于實際工業(yè)生產的發(fā)酵培養(yǎng)基[6]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌種與材料乳酸球菌RL-68，由皖西學院生物質煉制技術工程研究中心提供；餅干渣，由桐城雙武食品廠提供；番茄、香蕉、白菜、橘子、蘋果，均購自安徽省六安市南門菜市場。

1.1.2主要儀器722分光光度計，上海精密科學儀器有限公司生產；250B恒溫培養(yǎng)箱，江蘇金壇精達儀器制造廠生產；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器有限公司生產；SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產。

1.1.3培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏 5、蛋白胨 5、葡萄糖 40，pH值6.0～6.5，115 ℃滅菌15 min；種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10、蛋白胨10、葡萄糖50、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值為6.5～6.8，0.1 MPa 下滅菌20 min[7-10]；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨15、葡萄糖120、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCL 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值6.5～6.8，0.1 MPa下滅菌20 min[11-13]；平板計數(shù)培養(yǎng)基（MC培養(yǎng)基，g/L）：大豆蛋白胨5、牛肉膏粉5、酵母膏粉5、葡萄糖20、乳糖20、碳酸鈣10、瓊脂15、中性紅0.05，pH值6.0±0.2，0.1 MPa下滅菌20 min[14-16]。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)前，經2次傳代后，挑幾環(huán)乳酸球菌RL-68菌體接種于裝有300 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，用封口膜封口，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)：500 mL錐形瓶中裝入300 mL發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，取培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按體積分數(shù)1%接種量接種，恒溫靜置培養(yǎng)30 h[17-20]。

1.2.2測定方法活菌計數(shù)方法：平板涂布法，選擇3個合適的稀釋度，每個稀釋度做3個平皿，菌落數(shù)為3個平皿的平均值；菌液吸光度測定方法：722型分光光度計在620 nm條件下比色；pH值測定方法：pH計測定。

1.2.3乳酸球菌的生長曲線按體積分數(shù)1%的接種量將種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)，分別于10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測定培養(yǎng)基的吸光度（D值）。

2結果與分析

2.1乳酸球菌生長曲線

在種子培養(yǎng)過程中，分別于4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測定培養(yǎng)基的D值。由圖1可見，在前8 h，D值沒有明顯的變化，此時乳酸球菌處于延遲期，細胞正合成分裂所需要的物質；在8～12 h D值有升高，在12～18 h D值有明顯的升高，表明菌種生長進入對數(shù)期；18 h 后D值基本保持不變，即菌種進入穩(wěn)定期。為縮短菌種轉入發(fā)酵液中的延遲期，選擇種子培養(yǎng)中對數(shù)期的培養(yǎng)液較好，故選擇18 h作為接入發(fā)酵液的時間。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗

2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮比的影響試驗采用工業(yè)生產副產品餅干渣作為碳源，改變發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的碳氮比，基礎培養(yǎng)基中其他組分不變，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)[21-22]。由表1可見，當碳氮比小于5或者高于8時，培養(yǎng)基中活菌數(shù)數(shù)量級明顯下降，這說明乳酸球菌RL-68對于碳氮源的利用有其自身的最適度，當碳氮比為7時，培養(yǎng)基中的活菌數(shù)最高，可達到1.96×108 CFU/mL，故選取碳氮比為7作為優(yōu)化培養(yǎng)基的最適碳氮比。endprint

3小結與討論

通過單因素和正交試驗，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產菌量可達最高，為732×109 CFU/mL。本試驗利用工業(yè)生產產生的副產品為主要原料，獲得一個簡單、低成本、高產量、適用于實際工業(yè)生產的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗還有待進一步深入研究，如碳氮源固定比例問題是否可根據(jù)生產實際情況進一步調整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級的，但由于試驗時不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗中，對生長因子的影響將進一步開展研究。

參考文獻：

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3小結與討論

通過單因素和正交試驗，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產菌量可達最高，為732×109 CFU/mL。本試驗利用工業(yè)生產產生的副產品為主要原料，獲得一個簡單、低成本、高產量、適用于實際工業(yè)生產的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗還有待進一步深入研究，如碳氮源固定比例問題是否可根據(jù)生產實際情況進一步調整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級的，但由于試驗時不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗中，對生長因子的影響將進一步開展研究。

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3小結與討論

通過單因素和正交試驗，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養(yǎng)溫度35 ℃、靜置培養(yǎng)18 h，產菌量可達最高，為732×109 CFU/mL。本試驗利用工業(yè)生產產生的副產品為主要原料，獲得一個簡單、低成本、高產量、適用于實際工業(yè)生產的發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，本試驗還有待進一步深入研究，如碳氮源固定比例問題是否可根據(jù)生產實際情況進一步調整。另外，利用番茄汁和橘子汁發(fā)酵得到的活菌數(shù)是在同一數(shù)量級的，但由于試驗時不是橘子的成熟季節(jié)，故選取了番茄汁，在后續(xù)試驗中，對生長因子的影響將進一步開展研究。

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