復方中草藥肉雞飼料添加劑的抑菌及毒理學試驗

楊猛　黃亞東　伏陽

摘要：依據(jù)單味中草藥對肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖常見病原菌的抑菌效果和飼喂效果，結合中醫(yī)藥理論，配制出3劑中草藥復方制劑，研究3劑中草藥復方制劑的體外抑菌效果和毒理試驗，以期為復方中草藥肉雞飼料添加劑的研制奠定安全性基礎。結果表明，配制的3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且是一種無毒副作用的純天然綠色藥物。綜合抑菌試驗和毒理學試驗結果，復方制劑Ⅲ效果最佳。

關鍵詞：中草藥；飼料添加劑；安全性；復方制劑配方

中圖分類號： S816.75 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0223-03

收稿日期：2013-09-26

作者簡介：楊猛（1980—），男，江蘇濱海人，碩士，講師，主要研究方向生物藥物。E-mail：spxyym80@163.com。隨著肉雞飼養(yǎng)方式從散養(yǎng)型向規(guī)?；D(zhuǎn)變，其密度增加了1倍，密度的增加使發(fā)病率增加4倍以上。為保障肉雞的存活率，飼料添加劑的使用量逐漸增加，為肉雞養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展做出巨大貢獻的同時，也衍生出不少問題。飼料添加劑含有抗生素類藥物，可以提高肉雞的存活率和產(chǎn)量，但雞肉中藥物殘留的提高，直接危害了人類健康[1-3]。隨著人民生活水平的提高，人民的健康保健意識顯著增強，消費者對雞肉的品質(zhì)和安全性等方面的要求越來越高，低脂藥殘少的雞肉成為消費者的首選。基于上述需求，開發(fā)一種既能提高肉雞存活率和產(chǎn)量，又能改善雞肉品質(zhì)的飼料添加劑迫在眉睫，中草藥無毒副作用、無抗藥性、無污染、無殘留，且多為常見藥物，價格低廉，優(yōu)于抗生素，因而成為人們研究開發(fā)的首選對象[4-8]。本研究在單味中草藥對肉雞養(yǎng)殖常見菌抑菌和飼喂研究的基礎上，依據(jù)中藥配伍的原理，配制3劑中草藥復方制劑，并對其進行抑菌試驗、毒理試驗，篩選出效果最好的中草藥復方制劑，進行飼喂試驗，旨在為研制應用于實際肉雞養(yǎng)殖業(yè)的復方中草藥肉雞飼料添加劑奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗試劑

根據(jù)單味中草藥的抑菌效果和病原菌種類，結合中醫(yī)藥理論，配制出3劑中草藥復方制劑，分別為制劑Ⅰ、制劑Ⅱ、制劑Ⅲ[9]，配方如下。

制劑Ⅰ：桂皮40%、小茴香30%、肉桂10%、陳皮10%、甘草10%，水煎取汁；制劑Ⅱ：黃芪40%、肉桂30%、貫眾10%、何首烏10%、甘草10%，水煎取汁；制劑Ⅲ：金銀花40%、黃芪30%、茯芩10%、陳皮10%、甘草10%，水煎取汁。

其他試劑有：瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、無菌營養(yǎng)肉湯、抗雞紅細胞抗體、蒸餾水、無菌生理鹽水、小牛血清淋巴細胞分層液、0.8%戊二醛溶液、蘇木精和伊紅染色液。

1.2試驗動物

試驗動物為昆明種小白鼠。

1.3試驗儀器

試驗用儀器主要有：牛津杯、培養(yǎng)皿、TDL-40B低速臺式水平離心機、低溫冰箱、電熱恒溫水浴箱、OLYMPUS顯微鏡等。

1.4抑菌試驗方法

1.4.1藥敏性試驗采用牛津杯加注藥液的體外抑菌法。將12 cm滅菌培養(yǎng)皿分成6個扇區(qū)。將瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基倒平板，在每個平皿內(nèi)均勻加入0.5 mL已制備的病原菌稀釋菌液。將牛津杯按順序放入6個扇區(qū)中央，杯內(nèi)加入100 μL藥液，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果，并測量抑菌直徑。中草藥及復方的醇提物按同樣方法進行體外抑菌試驗[10]。

1.4.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC） 的測定根據(jù)水提物、醇提物抑菌結果，采用10倍稀釋法及2倍稀釋法，測定MIC和MBC。（1）10倍稀釋法：用無菌營養(yǎng)肉湯倍比稀釋藥液（終體積5 mL），使藥液濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4等4個梯度（同時以無菌生理鹽水作空白對照，不接種菌液作陰性對照）；接種病原菌稀釋菌液20 μL，搖勻；37 ℃ 培養(yǎng)24 h。以不顯示濁度、細菌未生長時的藥物濃度作為MIC，并取該管中0.05 mL 肉湯，接種于營養(yǎng)瓊脂平板；37 ℃ 培養(yǎng)24 h，平板上無菌落或菌落生長數(shù)≤10的藥物濃度為MBC[10]。（2）2倍稀釋法：根據(jù)10倍稀釋法結果，進一步確定MIC和MBC。無菌營養(yǎng)肉湯倍比稀釋藥液，濃度梯度為1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256、1 ∶512；MIC和MBC判定同10倍稀釋法[10]。

1.5毒理學試驗方法

1.5.1急性毒性試驗（LD50的測定） 根據(jù)此前預試驗結果，設20 000、30 000、45 000、67 500 mg/kg 4個劑量組（等比級數(shù)1.5）和1個空白對照組。取18～22 g小白鼠，每組10只，雌雄各半，連續(xù)給藥7 d，每天觀察小白鼠精神、食欲、飲水、活動及中毒情況，并記錄小白鼠的死亡數(shù)目[11-12]。

1.5.2蓄積毒性試驗（20 d蓄積試驗法）取體重15～18 g的小白鼠，每組10只，雌雄各半，設4個劑量組和1個對照組，按1 000、2 000、4 000、8 000 mg/kg的劑量進行灌胃給藥，連續(xù)給藥20 d，在給藥期間觀察小白鼠的精神、食欲、飲水、死亡情況和有無異常反應。給藥停止后觀察7 d內(nèi)小白鼠的死亡情況及體重的變化[11，13]。

1.5.3微核試驗取體重為18～22 g的成年小白鼠，每組10只，雌雄各半，設3個試驗組，1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，陽性組用環(huán)磷酰胺100 mg/kg腹腔注射。試驗組和對照組均采用2次染毒法，間隔時間為24 h，于第2次染毒后6 h將各組小白鼠全部采用頸椎脫位處死法，取股骨制骨髓涂片，每個小白鼠計數(shù)1 000個PCE（polychromatic erythrocytes，嗜多染紅細胞），微核率以‰表示[11]。endprint

1.5.4精子畸形試驗取體重20～25 g的雄性小白鼠，每組10只，設3個試驗組、1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，每日染毒1次，連續(xù)5 d，陽性組用環(huán)磷酰胺50 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)5 d。各組小白鼠于第35天處死，取附睪精子涂片，每只小白鼠計數(shù)1 000個完整精子，畸形率以‰表示[14-15]。

1.5.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗值以“平均數(shù)±標準差”表示，并采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1抑菌試驗結果

3結論

3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且復方制劑抑菌和殺菌效果均優(yōu)于單味中草藥，綜合考慮對6種菌的抑菌和殺菌效果，制劑Ⅲ優(yōu)于制劑Ⅰ、制劑Ⅱ。

急性毒理學試驗、蓄積毒性試驗、微核試驗和精子畸形試驗的試驗結果顯示，復方中草藥飼料添加劑是一種無毒副作用的純天然的綠色藥物。

參考文獻：

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[13]潘玉善，苑麗，胡功政，等. 肉雞大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測與藥敏分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010（2）：225-227.

[14]黃亞東，楊猛，王仁雷. 中草藥飼料添加劑對小白鼠的特殊致變作用的影響[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37（12）：19-20.

[15]沈建忠. 動物毒理學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：227-234.endprint

1.5.4精子畸形試驗取體重20～25 g的雄性小白鼠，每組10只，設3個試驗組、1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，每日染毒1次，連續(xù)5 d，陽性組用環(huán)磷酰胺50 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)5 d。各組小白鼠于第35天處死，取附睪精子涂片，每只小白鼠計數(shù)1 000個完整精子，畸形率以‰表示[14-15]。

1.5.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗值以“平均數(shù)±標準差”表示，并采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1抑菌試驗結果

3結論

3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且復方制劑抑菌和殺菌效果均優(yōu)于單味中草藥，綜合考慮對6種菌的抑菌和殺菌效果，制劑Ⅲ優(yōu)于制劑Ⅰ、制劑Ⅱ。

急性毒理學試驗、蓄積毒性試驗、微核試驗和精子畸形試驗的試驗結果顯示，復方中草藥飼料添加劑是一種無毒副作用的純天然的綠色藥物。

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[14]黃亞東，楊猛，王仁雷. 中草藥飼料添加劑對小白鼠的特殊致變作用的影響[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37（12）：19-20.

[15]沈建忠. 動物毒理學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：227-234.endprint

1.5.4精子畸形試驗取體重20～25 g的雄性小白鼠，每組10只，設3個試驗組、1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，每日染毒1次，連續(xù)5 d，陽性組用環(huán)磷酰胺50 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)5 d。各組小白鼠于第35天處死，取附睪精子涂片，每只小白鼠計數(shù)1 000個完整精子，畸形率以‰表示[14-15]。

1.5.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗值以“平均數(shù)±標準差”表示，并采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1抑菌試驗結果

3結論

3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且復方制劑抑菌和殺菌效果均優(yōu)于單味中草藥，綜合考慮對6種菌的抑菌和殺菌效果，制劑Ⅲ優(yōu)于制劑Ⅰ、制劑Ⅱ。

急性毒理學試驗、蓄積毒性試驗、微核試驗和精子畸形試驗的試驗結果顯示，復方中草藥飼料添加劑是一種無毒副作用的純天然的綠色藥物。

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[15]沈建忠. 動物毒理學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：227-234.endprint