基于胸腺嘧啶三聚氰胺胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)和SYBR Green Ⅰ熒光檢測牛奶中三聚氰胺

歐麗娟等

摘要基于胸腺嘧啶（T）三聚氰胺T特異性結(jié)構(gòu)，建立了SYBR Green Ⅰ熒光均相檢測三聚氰胺的方法。三聚氰胺不存在時，SYBR Green Ⅰ與聚T單鏈DNA結(jié)合較弱，熒光信號較弱；三聚氰胺存在時，聚T單鏈DNA通過T三聚氰胺T錯配形成折疊結(jié)構(gòu)。SYBR Green Ⅰ嵌入雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，釋放出強(qiáng)熒光信號。結(jié)果表明，三聚氰胺濃度在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為

1引言

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，其含氮量高，約為66.6%＼[1＼]，遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）。現(xiàn)用檢測食品中蛋白質(zhì)含量的方法為凱氏定氮法，它通過檢測食品中的含氮量確定蛋白質(zhì)的含量。因此，食品或飼料中添加三聚氰胺，會使蛋白質(zhì)含量虛高。同時，三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，無味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢測時蒙混過關(guān)。三聚氰胺與尿酸結(jié)合生成難溶于水的結(jié)石＼[2＼]，對人體健康構(gòu)成威脅，甚至可能引起嬰幼兒死亡。因此，準(zhǔn)確測定食品及飼料中的三聚氰胺含量具有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測三聚氰胺的方法有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法＼[3＼]、酶聯(lián)免疫檢測法＼[4＼]、高效液相色譜法＼[5＼]等。但是這些方法操作復(fù)雜， 需要高素質(zhì)的操作人員或者分析時間較長，不能滿足日?？焖俜治龅囊?。近年發(fā)展了一些檢測三聚氰胺的新方法，如電化學(xué)方法＼[6＼]、化學(xué)發(fā)光法＼[7＼]、納米材料比色法＼[8，9＼]、熒光探針法＼[10，11＼]和表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)＼[12＼]。盡管這些方法檢出限低、靈敏度高，但是預(yù)處理復(fù)雜耗時，需要衍生過程或者昂貴的儀器。

最近研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺可以通過分子間氫鍵介導(dǎo)胸腺嘧啶（T）配對，形成穩(wěn)定的T三聚氰胺T特異性結(jié)構(gòu)＼[13～15＼]。Huang研究小組＼[13＼]利用此原理實現(xiàn)了對三聚氰胺的比色檢測。聚T鏈在納米金表面吸附后，在一定鹽離子存在下，通過T三聚氰胺T特異性作用，納米金顆粒團(tuán)聚，宏觀上發(fā)生由紅色到藍(lán)色的顏色變化。盡管上述方法提高了三聚氰胺檢測的靈敏度，且具有較好的特異性，但需要合成納米金，操作復(fù)雜，成本高。SYBR Green Ⅰ（SG）是一種雙鏈DNA熒光染料。與單鏈DNA單獨(dú)存在時顯示非常弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光信號大大增強(qiáng)＼[16，17＼]。

本研究利用T與三聚氰胺的特異性結(jié)合，設(shè)計了一種均相檢測三聚氰胺的熒光傳感方法。三聚氰胺的存在促使聚T單鏈DNA改變其構(gòu)象，形成折疊結(jié)構(gòu)，SYBR Green Ⅰ（SG）與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號。本方法簡單，快速，成本低，靈敏度高， 可用于食品中三聚氰胺的現(xiàn)場快速檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Hitachi F7000熒光分光光度計（日本Hitachi公司）， 激發(fā)波長480 nm，掃描范圍505～580 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為5.0 nm。

三聚氰胺（上海百靈威科技有限公司）；SYBR Green Ⅰ （SG， 10000×，北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；DNA鏈（由大連寶生物有限公司合成）；其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水（電阻大于18.3 MΩ）。

2.2三聚氰胺的檢測

在25 μL反應(yīng)體系中包含10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4，200 mmol/L NaCl）、30 nmol/L聚T核酸鏈，2×SG； 加入系列濃度的三聚氰胺，混合均勻后，室溫下避光培育30 min后，稀釋到100 μL， 放入熒光光譜儀， 檢測熒光信號強(qiáng)度。

3結(jié)果與討論

3.1實驗原理

基于三聚氰胺特異性DNA和SG Ⅰ熒光定量檢測三聚氰胺的原理如圖1所示。三聚氰胺不存在時，聚T鏈為柔性的單鏈結(jié)構(gòu)，熒光信號很弱。因為SG Ⅰ是一種雙鏈核酸染料，與單鏈DNA的結(jié)合較弱，游離狀態(tài)下的SYBR Green Ⅰ只能發(fā)出微弱的熒光。當(dāng)三聚氰胺存在時，三聚氰胺能夠與胸腺嘧啶（T）通過分子間氫鍵形成T三聚氰胺T的特異性結(jié)構(gòu)（圖1B），使聚T鏈發(fā)生折疊。SG Ⅰ嵌入雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，在528 nm處釋放出強(qiáng)的熒光信號（圖1A）。利用檢測體系在該波長處熒光強(qiáng)度的變化，實現(xiàn)對三聚氰胺的定量檢測。

[TS（]圖1（A）基于胸腺嘧啶（T）三聚氰胺T特異性結(jié)構(gòu)和SG Ⅰ熒光檢測三聚氰胺的原理圖圖2是三聚氰胺存在與否的熒光發(fā)射光譜圖。當(dāng)只有SG存在時，溶液的熒光信號很弱（曲線a）。SG與聚T鏈共存，但三聚氰胺不存在時，SG通過靜電作用與單鏈DNA發(fā)生微弱的結(jié)合，發(fā)出比SG單獨(dú)存在下稍強(qiáng)的熒光信號（曲線b）。當(dāng)加入10 μmol/L三聚氰胺后，產(chǎn)生了強(qiáng)的熒光信號，約為SG與聚T鏈混合溶液的10倍（曲線c）。說明聚T鏈與目標(biāo)三聚氰胺結(jié)合形成了T三聚氰胺T配合物，促使單鏈DNA探針形成了穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)，SG與雙鏈DNA結(jié)合，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。同時，為了證明T與三聚氰胺的特異性作用，即傳感器對三聚氰胺的檢測要求探針是特異性的，選用一條富含G序列的非特異性探針（鏈的序列為：5′GGGTAGGGCGGGTTGGG3′），加入三聚氰胺，其它條件不變，進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2d，熒光強(qiáng)度并未顯著增大。說明三聚氰胺未與非特異性探針相互作用，不能形成折疊結(jié)構(gòu)，單鏈DNA不被SG染色，熒光信號很弱。

3.3實驗條件優(yōu)化

DNA鏈長度對熒光響應(yīng)信號有重要影響。本實驗選用兩種長度的DNA鏈（T24和T55）進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3A所示。T24鏈與T55鏈的響應(yīng)熒光信號強(qiáng)度相當(dāng)，但是長T55鏈的空白熒光信號值較高，降低了信噪比。所以，本實驗中采用的寡核苷酸鏈為T24。

SG濃度也是一個重要參數(shù)。SG濃度越大，熒光信號的增強(qiáng)越明顯，但是SG濃度過高，也會產(chǎn)生較高的背景。從圖3B可見（F和F0分別代表檢測體系中三聚氰胺存在與否的熒光強(qiáng)度），隨著SG濃度的增加， F/F0逐漸增加，于2×SG濃度處達(dá)到最大。故選取2×SG濃度作為最佳染料用量。

在反應(yīng)體系中，SG能與單鏈DNA發(fā)生微弱結(jié)合，產(chǎn)生較低的熒光強(qiáng)度。與雙鏈相比，雖然這種信號非常小，但是當(dāng)溶液中單鏈DNA的濃度較大時，這種影響也不可忽略。由圖3C可見，當(dāng)T24鏈的濃度為30 nmol/L時，F(xiàn)/F0值最大。因此，本實驗中DNA的濃度選擇為30 nmol/L。

三聚氰胺與T錯配雜交形成了折疊結(jié)構(gòu)，繼而SG嵌入雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，釋放出較強(qiáng)的熒光信號。因此，反應(yīng)時間的長短對于SG熒光定量有重要影響。從圖3D可知，當(dāng)反應(yīng)時間為30 min時實驗獲得了最佳的信倍比。故最優(yōu)反應(yīng)時間選擇30 min。

3.4傳感器的分析性能

在優(yōu)化的實驗條件下，對系列不同濃度的三聚氰胺進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖4A，熒光強(qiáng)度隨著三聚氰胺濃度在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)迅速增加。插圖為528 nm處熒光強(qiáng)度與三聚氰胺濃度的校正曲線圖。由圖4A可知，熒光強(qiáng)度與三聚氰胺濃度在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 用空白的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差原則確定檢出限為35 nmol/L，低于國際規(guī)定食品中三聚氰胺的含量，所以本方法適用于食品中三聚氰胺的檢測。

為了證明此傳感器的選擇性，選用一些與三聚氰胺具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)行了考察，如鄰苯胺、對苯胺、胞嘧啶和胸腺嘧啶。從圖4B可見，所考察的干擾物質(zhì)熒光強(qiáng)度都未得到明顯增強(qiáng)。說明此傳感器對三聚氰胺的檢測具有較高的選擇性。

4結(jié)論

構(gòu)建了一種基于胸腺嘧啶三聚氰胺胸腺嘧啶特異性結(jié)構(gòu)的光學(xué)傳感器用于三聚氰胺的檢測。三聚氰胺的存在使聚T鏈形成T三聚氰胺T結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，據(jù)此實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。本方法具有所用試劑簡單，不需要任何標(biāo)記，成本低；操作簡單，整個分析過程僅需30 min，分析周期短； 無需依賴大型儀器； 靈敏度高的特點(diǎn)。初步實現(xiàn)了牛奶中三聚氰胺的加標(biāo)回收檢測。本研究建立的非標(biāo)記的熒光傳感器，可滿足大多數(shù)檢測的需要，有望在乳制品、奶粉、原料乳等檢測中得到廣泛應(yīng)用。

References

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16ZHENG AiHua， ZHU Qing， XIANG DongShan， HE ZhiKe. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 325-329

鄭愛華， 朱 慶， 向東山， 何治柯. 分析化學(xué)， 2013， 41（3）： 325-329

17Zipper H， Brunner H， Bernhagen J. Nucleic Acids Res.， 2004， 32（12）： e103

AbstractA novel fluorescence homogeneous biosensing strategy was developed for simple， rapid and sensitive detection of melamine in milk by using the polythymine oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ. In the absence of melamine， the fluorescence of SYBR Green Ⅰ was weak. The interactions between the single strand oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ were weak. In contrast， the presence of melamine drove the formation of TmelamineT folded structure and enabled the SYBR Green Ⅰ to intercalate into doublestrand DNA， resulting in the enhancement of fluorescence intensity. The results revealed that the method allowed a sensitive， simple， and rapid assay of melamine with a linear response range from 0.1 μmol/L to 10 μmol/L and a detection limit of 35 nmol/L.

KeywordsTmelamineT； SYBR Green Ⅰ； Fluorimetry； Melamine

（Received 28 February 2014； accepted 3 April 2014）

This work was supported by the Natioal Natural Science Foundation of China （Nos. 21205035）， Hunan Province （Nos. 12JJ4017， 13JJ3123） and the Construct Program of the Key Discipline in Hunan Province.

16ZHENG AiHua， ZHU Qing， XIANG DongShan， HE ZhiKe. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 325-329

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KeywordsTmelamineT； SYBR Green Ⅰ； Fluorimetry； Melamine

（Received 28 February 2014； accepted 3 April 2014）

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AbstractA novel fluorescence homogeneous biosensing strategy was developed for simple， rapid and sensitive detection of melamine in milk by using the polythymine oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ. In the absence of melamine， the fluorescence of SYBR Green Ⅰ was weak. The interactions between the single strand oligonucleotide T24 and SYBR Green Ⅰ were weak. In contrast， the presence of melamine drove the formation of TmelamineT folded structure and enabled the SYBR Green Ⅰ to intercalate into doublestrand DNA， resulting in the enhancement of fluorescence intensity. The results revealed that the method allowed a sensitive， simple， and rapid assay of melamine with a linear response range from 0.1 μmol/L to 10 μmol/L and a detection limit of 35 nmol/L.

KeywordsTmelamineT； SYBR Green Ⅰ； Fluorimetry； Melamine

（Received 28 February 2014； accepted 3 April 2014）

This work was supported by the Natioal Natural Science Foundation of China （Nos. 21205035）， Hunan Province （Nos. 12JJ4017， 13JJ3123） and the Construct Program of the Key Discipline in Hunan Province.