化學(xué)誘變篩選耐消泡劑的阿維菌素高產(chǎn)菌株

韓娜

摘要：本文采用實(shí)驗(yàn)法，運(yùn)用亞硝酸誘變結(jié)合消泡劑來(lái)定向選育阿維菌素高產(chǎn)菌株，并得出了最終結(jié)論。

關(guān)鍵詞：亞硝酸誘變 消泡劑 阿維鏈霉菌 發(fā)酵

本課題通過(guò)紫外誘變的手段，選育耐消泡劑的菌株，提高菌體本身對(duì)消泡劑的耐受，促進(jìn)阿維菌素的合成，提高發(fā)酵單位。

1 材料與方法

1.1 菌種 出發(fā)菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的菌株AV-9。

1.2 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基（%）：可溶性淀粉1.0，氯化鈉0.05，硫酸按0.2，硫酸鎂0.1，輕質(zhì)碳酸鈣0.3，瓊脂粉1.5，pH：6.5～7.0。②種子培養(yǎng)基（%）：玉米淀粉3.0，黃豆餅粉0.8，花生餅粉1.0，酵母膏0.4，氯化鉆0.0003，淀粉酶4U/g淀粉，pH：6.8～7.0。③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：玉米淀粉15.0，豆餅粉2.5，酵母粉1.0，碳酸鈣0.05，加入適量微量元素，淀粉酶4U/g淀粉，pH：6.8～7.0。

1.3 培養(yǎng)條件：斜面和搖瓶的培養(yǎng)條件均為溫度28±1℃，相對(duì)濕度為45±5%。取0.1ml孢子液接入母瓶，220rpm培養(yǎng)40h，取1ml母瓶培養(yǎng)液接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)10天后放瓶。

1.4 誘變篩選方法：①菌懸液的制備：將成熟斜面加50ml蒸餾水，刮下孢子，單層擦鏡紙過(guò)濾備用。②誘變處理預(yù)試驗(yàn)：取過(guò)濾好的孢子液2ml與1M的醋酸緩沖液和0.1M的NaNO2溶液，按不同的比例混合，35℃保溫不同時(shí)間進(jìn)行處理，最后0.07M的Na2HPO4溶液終止反應(yīng)。待誘變菌株分離后，每組選取一定數(shù)量的菌株接搖瓶進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，統(tǒng)計(jì)正變率，并進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)。③單菌落的培養(yǎng)：將處理好的孢子液進(jìn)行一定量的稀釋后，涂布雙碟，雙碟中加入4%的消泡劑，以1.3所述條件培養(yǎng)11天，選取單菌落制備成大試管斜面，接搖瓶進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。④效價(jià)的測(cè)定：采用HPLC法，流動(dòng)相：甲醇：水=90：10，色譜柱：4.6mm*250mm 5μm，檢測(cè)波長(zhǎng)：246nm，進(jìn)樣量：10μl，流速：1.0ml/min。根據(jù)出峰面積計(jì)算出B1效價(jià)。⑤耐消泡劑菌株的驗(yàn)證：經(jīng)誘變選出的高單位菌株涂斜面，培養(yǎng)成熟后制備孢子液，取一定量的孢子液接入加4%消泡劑的搖瓶中，按④所述方法測(cè)定效價(jià)，同時(shí)以不加消泡劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硝酸最適誘變劑量的確定。亞硝酸不同加量時(shí)菌落致死率、變異率及正變率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：

由圖1可以看出，隨著亞硝酸濃度的提高，致死率不斷上升，在亞硝酸濃度為0.025時(shí)，致死率達(dá)到92.1%，此時(shí)的平均相對(duì)效價(jià)為112。其正變率最高，隨著亞硝酸濃度的繼續(xù)升高，致死率也在提高，但正變率卻在降低，可能誘變劑劑量過(guò)大，會(huì)對(duì)菌種的傷害也越大。所以此試驗(yàn)選擇亞硝酸濃度在0.025M，此時(shí)效價(jià)性狀的正變率最高。

2.2 高單位菌株的選出。經(jīng)誘變后，涂到加4%消泡劑的雙碟上，培養(yǎng)10天后，加消泡劑后，菌落普遍偏黃，在正常的固體培養(yǎng)基中點(diǎn)種培養(yǎng)，菌落恢復(fù)了原來(lái)外觀，選取200株菌落進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，經(jīng)初測(cè)復(fù)測(cè)得到5株效價(jià)明顯提高的菌株。將這5株菌分別接至含4%消泡劑發(fā)酵瓶中，進(jìn)行驗(yàn)證。效價(jià)情況如下：

由圖2可知，加消泡劑后菌株的效價(jià)水平普遍比不加消泡劑的低，說(shuō)明消泡劑的確對(duì)AV的合成有一定的不利影響，其中選出的9S-189號(hào)菌株，B1效價(jià)比出發(fā)菌株提高了14.1%，加消泡劑后比出發(fā)菌株對(duì)照提高了17.3%，此菌株是很有價(jià)值的菌株。

2.3 耐消泡劑菌株代謝特性的考察。將9S-189和AV-9兩菌株接搖瓶培養(yǎng)，從第3天至第10天。開始每天放3瓶進(jìn)行pH、總溏、效價(jià)等相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，以考察其代謝特性。

從以上圖表可以看出，新菌種pH一直維持在較高水平，糖代謝后的中間產(chǎn)物用于阿維菌素的合成，糖的利用率較高。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)得到的9S-189菌株對(duì)消泡劑的耐性的確有了一定的提高，并且此菌株在代謝特性上也發(fā)生了改變，使其更適應(yīng)高消泡劑的環(huán)境，但此菌株還需要在大罐進(jìn)一步驗(yàn)證。

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