原發(fā)性肺癌患者外周血中microRNA-31的表達(dá)及意義*

趙 靜，陳光輝，劉德軍，李 慧

河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450003

原發(fā)性肺癌患者外周血中microRNA-31的表達(dá)及意義*

趙 靜△，陳光輝，劉德軍，李 慧

河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450003

△女，1971年12月生，本科，副主任技師，研究方向：分子生物學(xué)，E-mail:zj971@126.com

microRNA-31；原發(fā)性肺癌；診斷；預(yù)后

目的：探討microRNA-31(miRNA-31)在原發(fā)性肺癌患者外周血中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測100例原發(fā)性肺癌患者和100例正常人外周血miRNA-31表達(dá)水平。繪制ROC曲線，評價(jià)外周血miRNA-31表達(dá)水平對原發(fā)性肺癌的診斷價(jià)值。以肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平的平均值為界值，將100例肺癌患者分為外周血miRNA-31低表達(dá)組和高表達(dá)組，采用Kaplan-Meier法對兩組繪制生存曲線，評價(jià)外周血miRNA-31表達(dá)水平對原發(fā)性肺癌預(yù)后判斷的價(jià)值。結(jié)果肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平為(1.93±0.88)，與正常人的(0.67±0.31)比較，明顯升高(t=13.505，P<0.001)。根據(jù)外周血miRNA-31表達(dá)水平繪制ROC曲線，曲線下面積為0.775(95%CI=0.681～0.868)，臨界值取1.126時(shí)，用外周血miRNA-31表達(dá)水平診斷原發(fā)性肺癌的靈敏度和特異度分別為0.778和0.736。肺癌患者中外周血miRNA-31低表達(dá)44例，高表達(dá)56例，高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.710，P=0.017)，低表達(dá)組中位生存期為37.32個(gè)月，長于高表達(dá)組的27.11個(gè)月。結(jié)論miRNA-31可作為原發(fā)性肺癌診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病人數(shù)呈逐年遞增的趨勢，5 a生存率只有15%左右，是人類因腫瘤所致死亡率最高的疾病[1]。microRNA(miRNA)指長度為21～25 nt、非編碼、單鏈小型RNA，能夠識別特定的靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)抑制其翻譯過程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用。已有研究[2-3]表明，miRNA-31在肺癌組織中高表達(dá)。關(guān)于miRNA-31在肺癌組織中表達(dá)及作用的研究較多，然而，有關(guān)其在外周血中表達(dá)情況的報(bào)道尚少。作者收集原發(fā)性肺癌患者外周血，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對miRNA-31的表達(dá)進(jìn)行檢測、分析，探討外周血miRNA-31表達(dá)水平在肺癌早期診斷及預(yù)后方面潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2005年5月至2007年12月在河南省人民醫(yī)院接受原發(fā)性肺癌切除術(shù)的患者100例，原發(fā)性肺癌均為初次發(fā)現(xiàn)，均經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)前未進(jìn)行任何放化療?；颊咧小?0歲41例，>60歲59例；吸煙64例，不吸煙36例；原發(fā)灶分級T1級38例，T2級35例，T3級27例；臨床分期Ⅰ期18例，Ⅱ期16例，Ⅲ期25例，Ⅳ期41例；高分化24例，中分化37例,低分化39例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例?；颊咝g(shù)后均進(jìn)行化療、放療等規(guī)范性治療。同時(shí)收集100份正常人外周血作為對照。

1.2外周血miRNA-31的測定RNAlater(美國Sigma Aldrich上海分公司)，TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA 定量檢測試劑盒(美國ABI公司)，逆轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物及TaqMan探針均由美國ABI公司合成。術(shù)前采集患者靜脈血，用EDTA抗凝管收集5 mL，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清裝入DEPC水處理過的EP管中，-80 ℃冰箱凍存。應(yīng)用Invitrogen公司Trizol試劑盒提取RNA，用微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。將總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，取均值。以miRNA-16作為內(nèi)參。miRNA-31表達(dá)水平用2-ΔCT計(jì)算，ΔCT=CTmiRNA-31-CTmiRNA-16。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。肺癌患者和正常人外周血miRNA-31表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同臨床病理特征肺癌患者外周血miRNA-31高表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)；建立ROC曲線以評估外周血miRNA-31表達(dá)水平對原發(fā)性肺癌的診斷價(jià)值；隨訪5 a，以死亡為終點(diǎn)事件，采用Kaplan-Meier法對外周血miRNA-31高表達(dá)和低表達(dá)肺癌患者繪制生存曲線，對兩條曲線進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1肺癌患者和正常人外周血miRNA-31表達(dá)水平的比較肺癌患者外周血miRNA-31的表達(dá)水平為(1.93±0.88)，正常人為(0.67±0.31)，肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平明顯高于正常人(t=13.505，P<0.001)。

2.2不同臨床病理特征肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平的比較以100例肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平的平均值1.93為分界值，外周血miRNA-31表達(dá)水平<1.93為低表達(dá)，≥1.93為高表達(dá)，則高表達(dá)56例，低表達(dá)44例。不同臨床病理特征肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平的比較見表1。

表1 不同臨床病理特征肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平的比較

2.3外周血miRNA-31表達(dá)水平對原發(fā)性肺癌的診斷價(jià)值ROC曲線見圖1。ROC曲線下面積(AUC)為0.775(95%CI=0.681～0.868)，當(dāng)臨界值取1.126時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為0.778和0.736。

圖1 ROC曲線

2.4肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系外周血miRNA-31高、低表達(dá)組肺癌患者的生存曲線見圖2。兩條生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.710，P=0.017)，低表達(dá)組中位生存期為37.32個(gè)月，長于高表達(dá)組的27.11個(gè)月。

圖2 生存曲線

3 討論

早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高肺癌治愈率、改善患者預(yù)后的有效方法，因此，尋找肺癌早期診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物有重要意義。隨著miRNA表達(dá)譜研究的進(jìn)展，人們逐漸將miRNA表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后聯(lián)系起來[4-5]。miRNA與腫瘤相關(guān)的最早證據(jù)來自2002年Calin等[6]的研究，他們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的miR-15a和miR-16-1表達(dá)降低或缺失。miRNA較強(qiáng)的穩(wěn)定性成為其作為腫瘤標(biāo)志物的先決條件[7-8]。miRNA在血漿和血清中非常穩(wěn)定，因此利用外周血相關(guān)miRNA表達(dá)水平對腫瘤進(jìn)行早期診斷，是一條值得探索的有效途徑。

Liu等[2]發(fā)現(xiàn)，miRNA-31在肺癌組織中高表達(dá)。Xi等[3]的研究證實(shí)，miRNA-31在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)為正常肺組織的4.13倍。作者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了100例原發(fā)性肺癌患者和100名正常人外周血miRNA-31的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：肺癌患者外周血miRNA-31表達(dá)水平明顯高于正常人；吸煙、高臨床分期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者外周血miRNA-31高表達(dá)率明顯高于不吸煙、低臨床分期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；根據(jù)外周血miRNA-31表達(dá)水平繪制的ROC曲線AUC達(dá)0.775(95%CI=0.681～0.868);生存分析結(jié)果顯示，外周血miRNA-31低表達(dá)的肺癌患者中位生存期要明顯長于高表達(dá)患者。研究結(jié)果說明外周血miRNA-31表達(dá)水平對肺癌具有較好的診斷價(jià)值，同時(shí)也可用于評估患者的預(yù)后。

綜上所述，該研究再次證實(shí)了miRNA-31在肺癌患者外周血中的存在，外周血miRNA-31表達(dá)水平可作為肺癌診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

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(2014-05-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression and significance of microRNA-31 in peripheral blood of primary lung cancer patients

ZHAOJing,CHENGuanghui,LIUDejun,LIHui

ClinicalLaboratory,HenanProvincialPeople'sHospital,Zhengzhou450003

microRNA-31;primary lung cancer;diagnosis;prognosis

Aim:To investigate the expression and clinical significance of microRNA-31(miRNA-31)in peripheral blood of primary lung cancer patients. Methods:Real-time PCR method was used to examine miRNA-31 in peripheral blood of 100 primary lung cancer patients and 100 healthy persons，respectively. ROC curve were drawn to evaluate the diagnosis value of miRNA-31 expression in peripheral blood for primary lung cancer.Based on the average of miRNA-31 expression in peripheral blood,the 100 lung cancer patients were divided into miRNA-31 low expression group and high expression group，Kaplan-Meier survival curves of the 2 groups were drawn. Results:miRNA-31 expression in peripheral blood of the primary lung cancer patients was (1.93±0.88)，higher than that (0.67±0.31) of the healthy persons(t=13.505,P<0.001). The area under the ROC curve according to the miRNA-31 expression in peripheral blood was 0.775(95%CI=0.681-0.868)，when the critical value was 1.126，the sensitivity for primary lung cancer diagnosis and specific degrees were 0.778 and 0.736，respectively. The difference in the survival curve between miRNA-31 low expression group(44 cases) and high expression group(56 cases) was statistically significant(χ2=5.710，P=0.017)，the median survival period of the low expression group was 37.32 months，longer than 27.11 months of the high expression group. Conclusion: MiRNA-31 expression in peripheral blood may be a molecular marker for the diagnosis and prognosis evaluation of primary lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.05.025

*河南省衛(wèi)生廳重大項(xiàng)目 201001008；河南省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目 112300410314

R734.2