雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞增殖及VEGF、HIF-1α表達(dá)的影響

張軍輝,嚴(yán)家芹,趙玉林

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 鄭州 450052

雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞增殖及VEGF、HIF-1α表達(dá)的影響

張軍輝1)△,嚴(yán)家芹2),趙玉林3)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科 鄭州 450052

△男，1978年1月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向：耳鼻喉科基礎(chǔ)和臨床，E-mail:zhangjunhui777@126.com

喉癌；缺氧；雷帕霉素；Hep-2；HIF-1α；VEGF

目的：探討雷帕霉素對缺氧條件下人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及VEGF、HIF-1α表達(dá)的影響。方法在缺氧條件下，采用MTT法檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2細(xì)胞的增殖活性，ELISA檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理24 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF蛋白含量的變化，Western blot檢測0、5、10、20 nmol/L雷帕霉素處理16 h細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果缺氧條件下雷帕霉素對Hep-2細(xì)胞仍具有明顯的增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴性(F濃度=253.132，F(xiàn)時間=213.945，P<0.05)。缺氧條件下雷帕霉素可抑制Hep-2細(xì)胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表達(dá)(F=7.045、16.218，P<0.05)。結(jié)論雷帕霉素可抑制缺氧條件下Hep-2細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制Hep-2細(xì)胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表達(dá)有關(guān)。

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部最常見的腫瘤之一。雖然近幾十年來傳統(tǒng)的喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總的生存率仍然很低。局部區(qū)域復(fù)發(fā)、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等是影響患者預(yù)后的主要因素[1]。喉癌的綜合治療已成為一種治療趨勢?；煂砬唤馄式Y(jié)構(gòu)和喉生理功能的保護(hù)作用使其在喉癌的治療中有著重要的意義，因此尋找高效、低毒的抗喉癌藥物十分重要[2]。該實驗觀察了缺氧條件下mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響；同時檢測了雷帕霉素作用后Hep-2細(xì)胞VEGF的分泌和HIF-1α蛋白表達(dá)的變化，探討雷帕霉素用作抗喉癌藥物的可能性及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人喉癌Hep-2細(xì)胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青工程材料有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)等試劑購自美國Sigma公司，HIF-1α和β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。ELISA試劑盒購自南京凱基生物有限公司。雷帕霉素購自美國Sigma公司，溶于RPMI 1640培養(yǎng)基制成10 μmol/L的母液，過濾除菌后-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(每mL含青霉素和鏈霉素各100 U)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3不同濃度的雷帕霉素作用不同時間對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞增殖的影響消化收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為7.5×104個mL-1，按100 μL孔-1接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后分為5組，實驗組加入雷帕霉素終濃度為5、10、20 nmol/L的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，另設(shè)陰性對照(0 nmol/L)和空白對照(調(diào)零孔)各6個復(fù)孔。將96孔板置于缺氧培養(yǎng)盒(體積分?jǐn)?shù)1%O2、5%CO2和94%N2，37 ℃)中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后終止。終止前4 h每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測各孔吸光度值(A值) ，計算增殖抑制率。增殖抑制率=(陰性對照組A值-實驗組A值)/陰性對照組A值×100%。

1.4不同濃度的雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞分泌VEGF的影響消化收集對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍。加入雷帕霉素終濃度為0、5、10、20 nmol/L的無血清培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心5 min，-80 ℃凍存?zhèn)溆?，計?shù)細(xì)胞。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品按100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37 ℃反應(yīng)120 min。加生物素標(biāo)記抗體，再加入抗人VEGF抗體工作液, 100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)60 min。加親和素-過氧化物酶復(fù)合物ABC，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)30 min。加入終止液，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)25 min。在酶標(biāo)儀上測定各孔A450 nm值。實驗重復(fù)3次。

1.5不同濃度的雷帕霉素對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響消化收集對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)至細(xì)胞間接近融合，加入雷帕霉素終濃度為0、5、10、20 nmol/L的培養(yǎng)基，于缺氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)16 h，提取細(xì)胞總蛋白。總蛋白濃度經(jīng)Bio-Rad測定后經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后加HIF-1α一抗(按1:200稀釋)4 ℃過夜。經(jīng)TBST漂洗后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h后熒光顯色，曝光、顯影和定影。掃描蛋白印跡膠片，以β-actin為內(nèi)參計算各組細(xì)胞目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用3×6析因設(shè)計的方差分析比較不同濃度和不同作用時間組間增殖抑制率的差異，采用單因素方差分析比較不同濃度組間Hep-2細(xì)胞VEGF與HIF-1α 蛋白表達(dá)的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的雷帕霉素作用不同時間對缺氧條件下Hep-2細(xì)胞增殖的影響見表1。由表1可見，雷帕霉素對Hep-2細(xì)胞增殖有抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。

表1 缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素作用不同時間Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率(n=6) %

F濃度=253.132，F(xiàn)時間=213.945，F(xiàn)交互=9.367，P均<0.001。

2.2缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素對Hep-2細(xì)胞分泌VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響見表2，圖1。

表2 缺氧條件下不同濃度的雷帕霉素對Hep-2細(xì)胞分泌VEGF及HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響(n=3)

圖1 雷帕霉素對缺氧誘導(dǎo)的Hep-2細(xì)胞HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響

1: 0 nmol/L雷帕霉素;2: 5 nmol/L雷帕霉素;3: 10 nmol/L雷帕霉素;4: 20 nmol/L雷帕霉素。

3 討論

實體腫瘤發(fā)展過程中的一種普遍現(xiàn)象是缺氧，為腫瘤細(xì)胞異常增生導(dǎo)致供氧與耗氧比例失衡所致。缺氧使腫瘤的生物學(xué)行為發(fā)生改變，表現(xiàn)為惡性程度增高，侵襲性增強(qiáng)，更易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，放化療的敏感性差等方面[3]。近年的研究[4]表明AKT/mTOR信號通路在喉癌組織中高表達(dá)，在喉癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Akt/mTOR信號通路活化后可以通過抑制細(xì)胞凋亡，拮抗細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]，呈濃度和時間依賴性。該實驗結(jié)果顯示缺氧條件下隨mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素濃度增加、作用時間延長，Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率逐步升高。

由于腫瘤細(xì)胞的快速生長，腫瘤細(xì)胞經(jīng)常處于氧缺乏環(huán)境中，因而血管生成就顯得尤為重要[6]。新生的腫瘤血管在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移過程中都扮演著十分重要的角色。腫瘤血管的生成是促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡異常導(dǎo)致。VEGF為促血管生成因子，是抑制腫瘤血管生成的主要靶基因[7]。該研究結(jié)果顯示，雷帕霉素作用于缺氧條件下的喉癌Hep-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達(dá)隨著雷帕霉素濃度的增加呈下降的趨勢，提示雷帕霉素可能通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的VEGF蛋白的表達(dá)來阻滯喉癌新生血管形成。

HIF-1α是人體在缺氧條件下廣泛表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子。在常氧情況下，HIF-1α易被蛋白水解酶降解，在細(xì)胞中基本檢測不到，然而在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞HIF-1α蛋白不被降解且成倍增加，增加的HIF-1α在缺氧調(diào)控的生理病理過程中起著重要作用[8-9]。有研究[10]表明HIF-1α在喉癌組織中高表達(dá)并與喉癌新生血管的形成密切相關(guān)。該研究結(jié)果顯示，雷帕霉素作用于缺氧條件下的喉癌Hep-2細(xì)胞16 h后，細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)隨雷帕霉素濃度的增加呈下降的趨勢，提示雷帕霉素可能通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白的表達(dá)來抑制VEGF的表達(dá)。

綜上所述，雷帕霉素可抑制Hep-2細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制缺氧誘導(dǎo)的Hep-2細(xì)胞VEGF的分泌，下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)有關(guān)。該研究為雷帕霉素用于喉癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(2014-03-17收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of rapamycin on proliferation of hypoxia-induced laryngeal cancer Hep-2 cells and expressions of VEGF and HIF-1α

ZHANGJunhui1)，YANJiaqin2)，ZHAOYulin3)

1)DepartmentofOtorhinolaryngology，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofOtorhinolaryngology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

laryngeal carcinoma; hypoxia; rapamycin; Hep-2; HIF-1α; VEGF

Aim: To study the effect of rapamycin on the proliferation of hypoxia induced laryngeal cancer Hep-2 cells and the expressions of VEGF and HIF-1α. Methods: MTT was used to observe the proliferation of Hep-2 cells treated with 0,5,10,20 nmol/L rapamycin for 12,24,36,48,60,72 h under hypoxia environment. ELISA was used to determine the content of VEGF in cell culture supernatant after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 24 h. Western blot was used to detect the expression of HIF-1α in the cells after 0,5,10,20 nmol/L rapamycin treatment for 16 h. Results: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells in a dose-dependent and time-dependent manner under hypoxia(Fconcentration=253.132,Ftime=213.945,P<0.05), significantly decrease the content of VEGF in Hep-2 cell culture supernatant and the expression of HIF-1α protein(F=7.045,16.218,P<0.05). Conclusion: Rapamycin could inhibit the proliferation of Hep-2 cells under hypoxia environment, which may be involved in its inhibiting the secretion of VEGF and decreasing the expression of HIF-1α.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.025

R739.65