CYP2D6基因多態(tài)性對(duì)帕羅西汀在河南漢族健康受試者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

周 霖，薛文華，張海朋，劉克鋒，趙 杰

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

CYP2D6基因多態(tài)性對(duì)帕羅西汀在河南漢族健康受試者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響

周 霖，薛文華，張海朋，劉克鋒，趙 杰#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

#通訊作者，男，1969年5月生，博士，教授，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)、藥物基因組學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)，E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn

CYP2D6；帕羅西汀；基因多態(tài)性；藥代動(dòng)力學(xué)；河南；漢族

目的：研究CYP2D6基因多態(tài)性對(duì)帕羅西汀在河南漢族健康受試者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響。方法河南漢族健康受試者48人，使用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)其進(jìn)行CYP2D6基因型檢測(cè)。受試者單劑量(7.5 mg)口服甲磺酸帕羅西汀膠囊后，收集120 h內(nèi)的系列血樣，用建立的LC-MS/MS法測(cè)定血漿帕羅西汀濃度，繪制藥-時(shí)曲線，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果男性CYP2D6*1/*1型受試者9人，CYP2D6*1/*10型21人；女性CYP2D6*1/*1型受試者5人，CYP2D6*1/*10型13人；未檢測(cè)到CYP2D6*10/*10型；男、女CYP2D6基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.027，P>0.999)。與CYP2D6*1/*1型男性受試者比較，CYP2D6*1/*10型男性受試者tmax、t1/2無明顯變化(Z=1.145，t=1.400，P>0.05)，CL(F)、Vd降低(Z=2.557，t=2.104，P<0.05)，ρmax、AUC0-120和AUC0-∞增加(Z=2.421、2.512、2.557，P<0.05)。與CYP2D6*1/*1型女性受試者比較，CYP2D6*1/*10型女性受試者ρmax、tmax、t1/2及Vd無明顯變化(Z=1.992、1.921，t=2.117、1.905，P>0.05)，但CL(F)降低(Z=2.021，P<0.05)，AUC0-120和AUC0-∞增加(Z=2.021、2.021，P<0.05)。結(jié)論CYP2D6*10突變等位基因可影響甲磺酸帕羅西汀在河南漢族健康人群體內(nèi)的代謝。

帕羅西汀為選擇性5-HT攝取抑制劑，7.5 mg的甲磺酸帕羅西汀于2013年6月28日被FDA批準(zhǔn)用于治療中度至嚴(yán)重伴絕經(jīng)血管舒縮癥狀，同時(shí)也是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的非激素治療、緩解更年期女性潮熱癥狀的藥物，但目前作用機(jī)制尚不明確。帕羅西汀在健康人體內(nèi)吸收和消除較慢，主要經(jīng)過人體的藥物代謝酶CYP2D6代謝，個(gè)體之間的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異較大[1-3]。CYP2D6有很多種突變類型(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)，其在亞洲人群中的突變類型主要是CYP2D6*10[4]。CYP2D6*10主要是由于外顯子1的188位點(diǎn)發(fā)生了C→T的點(diǎn)突變，致使蛋白酶34位上的脯氨酸(Pro)變成絲氨酸(Ser)，形成了活性低且不穩(wěn)定的代謝酶[5]。目前，有關(guān)CYP2D6基因多態(tài)性與帕羅西汀代謝個(gè)體差異的關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。因此，作者建立了檢測(cè)帕羅西汀血漿濃度的LC-MS/MS法，應(yīng)用該方法對(duì)河南漢族健康志愿者48人進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)不同CYP2D6基因型受試者帕羅西汀體內(nèi)代謝的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較、分析，以期為臨床個(gè)體化用藥提供理論指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象河南漢族健康志愿者48人，其中女18人，男30人。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～45歲，體重50～90 kg，體重指數(shù)(BMI)18～30 kg/m2，無煙酒等不良嗜好，無心、肝、脾、肺、腎、消化系統(tǒng)等疾病史，心電圖、血常規(guī)、血壓、肝腎功能、尿常規(guī)、傳染病等實(shí)驗(yàn)室檢查無異常，近2周內(nèi)沒有服用任何處方藥，均簽署知情同意書。知情同意書以及試驗(yàn)方案經(jīng)過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑甲磺酸帕羅西汀膠囊，規(guī)格7.5 mg/粒，由Noven藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。甲磺酸帕羅西汀對(duì)照品(批號(hào)FN102209-01)、甲磺酸帕羅西汀D6(內(nèi)標(biāo)，批號(hào)FN031709-01)由Cerilliant公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸為HPLC級(jí)，氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純，純化水(18.2 MΩ·cm)、血漿以及K2-EDTA(上海Bioreclamation公司)。

1.3CYP2D6基因型檢測(cè)取研究對(duì)象外周靜脈血5 mL置于K2-EDTA抗凝管中。用DNA提取試劑盒按照操作說明提取DNA。設(shè)計(jì)特異性引物[6]，利用PCR-RFLP對(duì)CYP2D6基因進(jìn)行分型。型別包括野生純合子CYP2D6*1/*1、雜合子CYP2D6*1/*10，突變純合子CYP2D6*10/*10。

1.4帕羅西汀血漿濃度LC-MS/MS測(cè)定方法的建立及方法學(xué)確證[7]

1.4.1 血漿樣品的處理 精密吸取200 μL血漿樣品至1.5 mL塑料離心管中，加入20 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，混勻，加入0.1 mol/L的NaOH溶液200 μL，混勻，再加入正己烷2 mL，渦旋10 min，于離心機(jī)中以3 500 r/min離心10 min，取有機(jī)層，吹干，待測(cè)。

1.4.2 LC-MS/MS系統(tǒng)的建立 API-5000型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司),HPLC(Shimadzu公司)，自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜條件：色譜柱為XbridgeTMC18, 30×4.6 mm，3.5 μm；流動(dòng)相為體積比為1:1的乙腈/甲醇緩沖液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的甲酸)；流速為1.0 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為5 ℃；進(jìn)樣量20 μL。質(zhì)譜條件：選用電噴霧離子源，正離子電模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描方式；帕羅西汀的檢測(cè)離子為m/z 330.2→192.2，內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子為m/z 336.2→198.2。質(zhì)譜參數(shù)：霧化溫度500 ℃，噴霧電壓5 000 V，碰撞氣6 L/min，簾氣15 L/min，霧化氣50 L/min，輔助氣40 L/min。 色譜圖用Analyst 1.4.2程序進(jìn)行分析。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取空白血漿180 μL，分別加入系列濃度的帕羅西汀對(duì)照品并混勻，配制成相當(dāng)于血漿帕羅西汀質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.20、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 μg/L的質(zhì)控樣品，按1.4.1處理后，按1.4.2進(jìn)樣檢測(cè)，記錄帕羅西汀的峰面積As和內(nèi)標(biāo)物峰面積Ai。以質(zhì)量濃度ρ為X、以f(f=As/Ai)為Y進(jìn)行權(quán)重回歸，權(quán)重系數(shù)為1/ρ2。

1.4.4 精密度、回收率和穩(wěn)定性測(cè)定 ①精密度：分別配置0.06(低質(zhì)量濃度)、3.00(中質(zhì)量濃度)、15.00(高質(zhì)量濃度) μg/L的帕羅西汀質(zhì)控樣品各6份，分3批進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)和日間變異。②回收率：分別配置低、中、高3種質(zhì)量濃度的帕羅西汀質(zhì)控樣本各3份，進(jìn)行測(cè)定；另外取6份不同來源的雙空白血漿200 μL，加入配制成低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按1.4.1處理后，進(jìn)樣檢測(cè)；根據(jù)兩次測(cè)定結(jié)果，計(jì)算提取回收率。③穩(wěn)定性：分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的帕羅西汀質(zhì)控樣品，于室溫下放置22 h，反復(fù)凍融4次，-70 ℃凍存36 d后檢測(cè)，考察方法的穩(wěn)定性。

1.4.5 基質(zhì)效應(yīng) 取6份不同來源的雙空白血漿，分別配制成低、中、高質(zhì)量濃度的帕羅西汀質(zhì)控樣品，按1.4.1處理后，按1.4.2進(jìn)樣檢測(cè)、記錄帕羅西汀和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積As(A)與Ai(A)。另取純化水200 μL至1.5 mL塑料離心管中，共18個(gè)樣品，按1.4.1操作，按1.4.2進(jìn)樣測(cè)定，記錄帕羅西汀和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積As(B)與Ai(B)。帕羅西汀的基質(zhì)效應(yīng)ME=As(A)/As(B)×100%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)MEi=Ai(A)/Ai(B)×100%。

1.5研究對(duì)象帕羅西汀血藥濃度的測(cè)定研究對(duì)象單劑量口服甲磺酸帕羅西汀膠囊7.5 mg(240 mL室溫水送服)，于服藥前90 min內(nèi)和服藥后1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、20.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0、120.0 h于肘靜脈采集血樣5 mL，置于K2-EDTA化的采血管中，立即放入碎冰中，在采集后30 min內(nèi)置低溫(4 ℃)離心機(jī)內(nèi)3 500 r/min離心10 min，分離后得血漿，于-70 ℃冰箱中冷凍保存。應(yīng)用1.4中建立的 LC-MS/MS法測(cè)定帕羅西汀血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線，曲線的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)用DAS 2.0計(jì)算。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，同一性別不同基因型受試者各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1一般資料男性受試者中，CYP2D6*1/*1型9人，CYP2D6*1/*10型21人；女性受試者中，CYP2D6*1/*1型5人，CYP2D6*1/*10型13人；未檢測(cè)到CYP2D6*10/*10型。男、女CYP2D6基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.027，P>0.999)。不同基因型受試者的年齡、體重、身高差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 不同基因型受試者一般資料的比較

2.2LC-MS/MS方法的評(píng)價(jià)色譜圖見圖1，可見帕羅西汀和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.21 min和1.20 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.484 872X+0.000 335(R2=0.999 5)，檢測(cè)范圍為0.02～20.00 μg/L。帕羅西汀低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品測(cè)得的日內(nèi)變異分別為5.0%、3.3%和4.5%，日間變異分別為3.4%、5.0%和4.3%，提取回收率分別為53.1%、 52.6%和46.1%。樣品在室溫下放置22 h，反復(fù)凍融4次，-70 ℃凍存36 d條件下穩(wěn)定。低和高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為(103±5)%和(102±5)%。

圖1 帕羅西汀(上)和內(nèi)標(biāo)(下)的色譜圖

2.3不同CYP2D6基因型受試者帕羅西汀藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較藥-時(shí)曲線見圖2，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較見表2、3。

圖2 單劑量口服甲磺酸帕羅西汀7.5 mg后的藥-時(shí)曲線

上：男性；下：女性；-●-：CYP2D6*1/*10型；-■-：CYP2D6*1/*1型。

表2 不同CYP2D6基因型男性受試者帕羅西汀藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

*：兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表3 不同CYP2D6基因型女性受試者帕羅西汀藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

*：兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 討論

帕羅西汀為2013年被FDA批準(zhǔn)用于臨床的藥物。帕羅西汀經(jīng)口服后可被完全吸收，食物對(duì)其吸收影響不大；在臨床條件下，其血漿蛋白結(jié)合率約為95%，可迅速在體內(nèi)各組織中廣泛分布，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)；多次給藥后大約12 d可達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，達(dá)峰時(shí)間為6 h；在7.5 mg劑量下帕羅西汀在人體內(nèi)代謝呈非線性動(dòng)力學(xué)[1]。

藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程主要靠藥物代謝酶來完成。代謝帕羅西汀的藥物酶為CYP2D6，該酶容易飽和，故帕羅西汀可出現(xiàn)過量蓄積現(xiàn)象[1]。酶的遺傳多態(tài)性導(dǎo)致了人群中酶的結(jié)構(gòu)和含量不同，最終的結(jié)果是相同的藥物在不同人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有差異性，從而出現(xiàn)機(jī)體對(duì)藥物的不同反應(yīng)。CYP2D6的突變類型較多，其中*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人群中都有發(fā)現(xiàn)，*2和*17主要存在于非洲人群中，而*10是亞洲人群的主要突變類型[4]。CYP2D6*10在中國人群中的頻率為52.53%，顯著高于高加索人群(1.53%)，稍高于韓國人群(45.00%)[8-9]。因此，作者對(duì)河南健康漢族人群中不同CYP2D6基因型受試者帕羅西汀的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較。

作者首先對(duì)48個(gè)受試者進(jìn)行了CYP2D6基因多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果CYP2D6*1/*1型共檢出14(29.17%)人，其中男9人，女5人；*1/*10型共檢出34(70.83%)人，其中男21人，女13人；未檢測(cè)到*10/*10型。男、女CYP2D6基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作者建立了測(cè)定血漿帕羅西汀濃度的LC-MS/MS方法，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法的測(cè)定精密度、回收率和穩(wěn)定性都較好，能夠滿足研究的需要。進(jìn)一步的藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，在男性受試者中，與CYP2D6*1/*1基因型者比較，CYP2D6*1/*10型者tmax、t1/2無明顯變化，CL(F)、Vd降低，ρmax、AUC0-120和AUC0-∞增加。在女性受試者中，與CYP2D6*1/*1基因型者比較，CYP2D6*1/*10型者ρmax、tmax、t1/2及Vd無明顯變化，CL(F)降低，AUC0-120和AUC0-∞增加。結(jié)果說明，無論男性還是女性，*10突變等位基因可使帕羅西汀在健康人體中的代謝減慢。王蒙等[10]也對(duì)CYP2D6基因多態(tài)性與帕羅西汀在人體內(nèi)代謝的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果也表明CYP2D6基因多態(tài)性可影響帕羅西汀在健康人體中的代謝。

近年來，應(yīng)用基因多態(tài)性指導(dǎo)臨床合理用藥的方法已經(jīng)被廣泛接受。該研究說明，應(yīng)用基因多態(tài)性與血藥濃度檢測(cè)相結(jié)合的方法可以預(yù)測(cè)新上市的藥物在某相關(guān)基因不同基因型的人群中的藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，根據(jù)基因多態(tài)性制定藥物治療方案，可以彌補(bǔ)單純應(yīng)用血藥濃度監(jiān)測(cè)來制定個(gè)體化用藥方案的不足。同時(shí)，該研究也為個(gè)體化臨床用藥提供了新的思路和方法[11]。

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(2014-06-11收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Influence of CYP2D6 genetic polymorphism on pharmacokinetics of paroxetine in Henan Han healthy subjects

ZHOULin，XUEWenhua，ZHANGHaipeng，LIUKefeng,ZHAOJie

DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

CYP2D6;paroxetine;genetic polymorphism;pharmacokinetics；Henan；Han population

Aim: To investigate the influence of CYP2D6 genetic polymorphism on pharmacokinetics of paroxetine in Henan Han healthy people.Methods: A total of 48 Han healthy volunteers from Henan Province were subjected to detect genetic polymorphied by PCR-RFLP method. The volunteers were given a single oral dose of paroxetine mesylate capsule(7.5 mg), and blood samples were collected at different time points until 120 h. The concentrations of paroxetine in plasma were measured by LC-MS/MS method, and the pharmacokinetics was analyzed.Results: There were 9 males with CYP2D6*1/*1, 21 with CYP2D6*1/*10,5 females with CYP2D6*1/*1 and 13 with CYP2D6*1/*10, and the distribution of CYP2D6 genetic polymorphism between the male and the female had no difference(χ2=0.027，P>0.999). Compared with the male with CYP2D6*1/*1,tmax,t1/2of the male CYP2D6*1/*10 subjects had no changes(Z=1.145，t=1.400，P>0.05),CL(F) andVddecreased(Z=2.557，t=2.104，P<0.05),ρmax,AUC0-120andAUC0-∞increased(Z=2.421,2.512,2.557，P<0.05). Compared with the female CYP2D6*1/*1 subjects,ρmax,tmax,t1/2andVdof the females with CYP2D6*1/*10 had no changes(Z=1.992,1.921，t=2.117,1.905，P>0.05),CL(F) decreased(Z=2.021，P<0.05),AUC0-120andAUC0-∞increased(Z=2.021,2.021，P<0.05).Conclusion: The mutation CYP2D6*10 could lead to the metabolic phenotype changes of paroxetine mesylate in Henan Han healthy subjects.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.020

R969.1