基于普魯士藍/雙胺氧化酶修飾的生物胺傳感器

肖艷華，史 妮，汪俊麗，楚 汨，馬 銘，謝青季，譚月明，蘇孝禮

(湖南師范大學化學化工學院，化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，中國 長沙 410081)

基于普魯士藍/雙胺氧化酶修飾的生物胺傳感器

肖艷華，史 妮，汪俊麗，楚 汨，馬 銘，謝青季，譚月明*，蘇孝禮*

(湖南師范大學化學化工學院，化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，中國 長沙 410081)

通過殼聚糖及戊二醛將雙胺氧化酶固定在普魯士藍修飾的玻碳電極表面，制備了生物胺傳感器．考察了該傳感器的電化學特性并優(yōu)化了實驗條件．結果表明，在優(yōu)化條件下所制備的傳感器的電流響應與組胺濃度在0.33μmol/L～3.3mmol/L(3.7×10-2～3.7×102mg/L)范圍內相關；檢測限(S/N=3)為0.05μmol/L(6μg/L)．該傳感器具有響應范圍寬、靈敏度高、選擇性強、簡便快速的特點．

生物胺；雙胺氧化酶；普魯士藍；安培型傳感器

生物胺是一類具有生物活性的低分子量有機含氮化合物的總稱，主要通過氨基酸的脫羧作用生成[1-2].根據結構可將其分為3類[3]：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)；芳香族(酪胺、苯乙胺等)；雜環(huán)族(組胺、色胺等)．適量的生物胺有助于人體的正常生理功能，過量則會引起不良的生理反應，如出現頭痛、心悸、腹瀉、休克等中毒癥狀[4]．生物胺廣泛存在于肉類、水產品、乳制品、酒類和飲料等食品中，在食品中的含量與食品的質量有一定的相關性[5-6]．美國FDA規(guī)定水產品中組胺含量不超過50 mg/kg，酪胺不超過100 mg/kg，總胺不超過1 000 mg/kg；歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不超過100 mg/kg，總胺不超過300 mg/kg[7]．

檢測食品中的生物胺有助于監(jiān)控食品的質量及安全性．現有的生物胺檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法等，這些方法存在費時、儀器昂貴、操作繁瑣等缺點．本文工作旨在研究開發(fā)靈敏、簡便、快速的電化學生物胺傳感器檢測方法．已有的這類傳感器大多直接檢測胺氧化酶與生物胺反應生成的H2O2的氧化電流[8]，或利用固定化辣根過氧化物酶和游離的電子媒介物檢測酶反應生成的H2O2[9-10]．前者工作電位較高，干擾較多；后者構造相對復雜(涉及雙酶體系)且操作不便(需在測試液中加入一定量的電子媒介物)．

普魯士藍(Prussia blue，PB)是一種多核過渡金屬氰化物，制備的PB修飾電極具有獨特的電化學可逆性、高度的穩(wěn)定性、易制備等特點，在電催化方面有很大的應用潛力．PB對過氧化氫的高靈敏催化作用在生物電化學領域的應用尤其備受關注，被稱為“人工過氧化物酶”[11-12]．殼聚糖是自然界中廣泛存在的殼質經過脫乙酰作用得到的產物，具有豐富的氨基和羥基．它無味、無臭、無毒，且不易溶于水、成膜性好、粘附能力強、機械強度高、生物相容性好、對酶有較好的親和力，并能有效地防止酶和電子媒介物的泄漏．因此在制備酶電極的過程中，殼聚糖是一種非常有用的固定材料[13-14]．戊二醛含有豐富的醛基，可用于蛋白質固定，是傳感器構建中常用的交聯劑．

基于以上分析，本實驗先在電極表面電沉積普魯士藍，然后利用殼聚糖和戊二醛將雙胺氧化酶固定在電極表面，制備了一種安培型生物胺酶傳感器．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)，玻碳電極作為工作電極(天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)，AgCl/Ag參比電極(上海雷磁儀器廠)，213型鉑為對電極(上海雷磁儀器廠)．雙胺氧化酶(Diamine oxidase, DAO, EC 1.4.3.6, ≥0.05 units/mg, Sigma-Aldrich)，組胺(國藥集團化學試劑有限公司)，酪胺(上海晶純試劑有限公司)，腐胺(成都西亞試劑有限公司)，精胺(Johnson Matthey Company),亞精胺(上海晶純試劑有限公司)，尸胺(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，胍丁胺(Tokyo Chemical Industry Company)，二硫基乙胺(Adamas Reagent Company)，殼聚糖(上海國藥集團，脫乙酰度≥90.0%)，30%過氧化氫(長沙市分路口塑料化工廠)，50%戊二醛(天津市大茂化學試劑廠)．所用試劑均為分析純．除酪胺溶于無水乙醇外，其他試劑均由磷酸緩沖溶液(PBS, pH 7.0, 0.1 mol/L KH2PO4/Na2HPO4，含0.1 mol/L KCl)配制．

1%殼聚糖的制備：稱取0.1 g 殼聚糖加入到10 mL 2% (V/V)的醋酸溶液中，室溫下磁力攪拌3 h至完全溶解．然后用1.0 mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液pH至4.6．

1.2 PB膜修飾電極的制備

玻碳電極(直徑3 mm)依次用6#金相砂紙、0.3 μm、0.05 μm氧化鋁拋光粉拋光打磨．然后在1.0 mol/L NaOH、無水乙醇及二次蒸餾水中分別超聲洗滌5 min，在室溫下晾干．將清洗干凈的玻碳電極插入新配制的含2.5 mmol/L K3Fe(CN)6、2.5 mmol/L FeCl3、0.1 mol/L KCl和0.1 mol/L HCl的溶液中，在恒電位0.4 V工作電位下電沉積300 s，制得PB膜修飾電極．然后將制得的電極置于含0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L HCl的溶液中，以0.05 V/s掃速在-0.05～0.35 V間掃描20圈至穩(wěn)定．電極在100 ℃下烘干1 h備用．

1.3 生物胺傳感器的制備

首先取5 μL 120 mg/mL DAO滴于沉積有PB的玻碳電極表面．待晾干后，取5 μL 1% 殼聚糖溶液滴于電極表面晾干．最后滴加5 μL 0.25% 戊二醛滴于電極表面，晾干，制得生物胺傳感器．將修飾好的傳感器置于4 ℃冰箱中保存．使用時用PBS(pH 7.0)清洗電極，以除去未固定上的酶液．

1.4 生物胺傳感器的測試

將制得的傳感器置于含3 mL PBS的電解池中作為工作電極，以鉑片為對電極，AgCl/Ag電極為參比電極，采用三電極體系，在室溫、恒電位下，磁力攪拌．待背景電流穩(wěn)定后注入一定體積的H2O2或生物胺樣品溶液，記錄傳感器對H2O2或生物胺的響應電流．背景電流與響應電流的差值為加入樣品的響應電流．

2 結果與討論

2.1 傳感器的電化學響應及響應機理

圖1為生物胺傳感器在有無H2O2存在時的循環(huán)伏安圖．加入H2O2溶液后，氧化電流明顯減小，還原電流明顯增大，表明電沉積的PB能很好地電催化還原H2O2．當測定生物胺時，溶液中的生物胺向電極表面擴散，在DAO的催化下與O2反應發(fā)生產生相應醛類、NH3和H2O2[15]，見圖2及反應式(1)和(2)．通過檢測H2O2在電極表面的還原電流，即可測定生物胺．

圖1 生物胺傳感器在未知(a)以及加入(b)H2O2時的循環(huán)伏安圖，掃速：50 mV/sFig.1 Cyclic voltammograms of the biosensor in PBS containing 0 (a) or 3.3 mmol/L (b) H2O2, scan rate: 50 mV/s

RCH2NH2+H2O+O2RCHO+H2O2+NH3 (1)K2Fe2+Fe2+(CN)6(PW)KFe3+Fe2+(CN)6(PB)+K+ (2)

2.2 傳感器工作條件的優(yōu)化

為提高傳感器的選擇性和靈敏度，對工作電位進行了優(yōu)化．如圖3所示，-0.15 V下的電流響應明顯高于其他電位，因此，作者選擇工作電位為-0.15 V．而-0.2 V時響應較-0.15 V時的低，是因為背景電流的影響所致．

考察了緩沖溶液的pH值對傳感器響應電流的影響(見圖4)．在pH 6.0～7.0范圍內，響應靈敏，但其響應值相差不大．雖然PB在酸性溶液中的響應較高一些，但為避免殼聚糖在酸性溶液中溶出而影響傳感器的穩(wěn)定性，作者選擇pH 7.0的緩沖溶液為電解質．

工作電位：a.-0.05 V; b.-0.1 V; c.-0.15 V; d.-0.2 V

圖4 pH值對傳感器電流響應的影響(組胺濃度為3.3 mmol/L)Fig.4 Effect of pH on the amperometric response of the biosensor of the biosensor

PB膜的電沉積時間會影響傳感器的性能．電沉積的時間過短，傳感器的響應電流小，線性范圍較窄．電沉積的時間過長，PB膜厚度過大，會阻礙電子的傳遞，也會影響傳感器響應的各項性能．圖5顯示了不同沉積時間對傳感器響應的影響．當沉積時間從100 s增加到400 s時，響應信號先增加后降低；當沉積時間為300 s時，響應達到最大．因此，作者選擇沉積時間為300 s．

戊二醛作為交聯劑，可以使殼聚糖分子之間相互交聯形成網狀結構，有利于將酶液固定在電極表面．當戊二醛濃度太低時，固定在電極表面的酶層在經過幾次測試后逐漸流失；當戊二醛濃度太高時，會導致酶的活力降低．如圖6所示，當使用的戊二醛的質量分數為0.25%時，傳感器的的響應最大．因此，在后續(xù)的實驗中選擇戊二醛質量分數為0.25%．此外，實驗發(fā)現，當不修飾戊二醛時，傳感器雖有響應，但是隨著測試的進行，修飾層有脫落現象，不利于構建穩(wěn)定性好的傳感器．

沉積時間：a.100 s; b.200 s; c. 300 s; d.400 s

戊二醛質量分數：a.0.25%;b.0.5%;c.1.0%

殼聚糖的濃度對傳感器響應有一定的影響(見圖7)．當殼聚糖質量分數為1%時，酶液流失較少，傳感器的響應最大；當殼聚糖質量分數較低時，固定的酶液相對較少，導致響應較低．因此選擇采用質量分數為1%的殼聚糖固定酶．

2.3 傳感器的響應性能

從圖7中曲線a可以看出，在最優(yōu)化條件下，傳感器對0.33 μmol/L～3.3 mmol/L(3.7×10-2～3.7×102mg/L)濃度范圍內的組胺具有較靈敏的響應；隨著組胺濃度的不斷增加，電流響應明顯增大．其中傳感器在0.33～1.3 μmol/L低濃度區(qū)間的電流-時間響應曲線和電流響應-濃度關系曲線見圖8．結果顯示在該區(qū)間，傳感器的電流響應與組胺濃度呈良好的線性關系：Δi(nA)=17.2c(μmol/L)+0.80 (r=0.989 6)．背景電流的噪聲水平(N)為0.29 nA，0.33 μmol/L組胺濃度對應的信噪比(S/N)高達22，計算的最低檢測限(S/N=3)為0.05 μmol/L(6 μg/L)．該靈敏度優(yōu)于已報道的其他電化學生物胺傳感器(檢測限一般在μmol/L級)[9-10]．

該傳感器在μmol/L級濃度區(qū)間每50 s可以完成對一個樣品的測試(見圖8)，在高濃度區(qū)間的響應時間約為15 s．用同一支電極對3.3 mmol/L的組胺連續(xù)測試7次，響應電流的相對標準偏差為13%．在3.3 mmol/L組胺溶液中測試穩(wěn)定性，結果表明經過15 d后傳感器的靈敏度保持了90%．

殼聚糖質量分數：a.1.0%; b.0.5%; c.0.25%

箭頭代表在含3 mL PBS電解池中依次加入10 μL 0.1 mmol/L組胺溶液

2.4 傳感器的選擇性

在優(yōu)化的實驗條件下，考察傳感器對8種不同生物胺的檢測．當樣品濃度均為3.3 mmol/L時，除對尸胺響應不明顯外，傳感器對其余7種生物胺均有明顯的響應(見圖9)．以對組胺的響應值為參比，相對響應值按從大到小順序排列分別為：二硫基乙胺(1.92)、精胺(1.84)、腐胺(1.28)、組胺(1)、亞精胺(0.68)、酪胺(0.39)、胍丁胺(0.18)．1 mmol/L抗壞血酸和其他物質如葡萄糖、尿素、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸等均無干擾．

3 結論

采用殼聚糖和戊二醛固定化雙胺氧化酶，并利用普魯士藍對過氧化氫的高效電催化，制備了基于普魯士藍/雙胺氧化酶修飾電極的生物胺傳感器．該傳感器具有檢測范圍寬、檢測限低、選擇性好等優(yōu)點．有望為食品中生物胺的檢測提供一種簡便快速的方法．

[1] KIM B, BYUN B Y, MAH J H. Biogenic amine formation and bacterial contribution in Natto products [J]. Food Chem, 2012,135(3):2005-2011.

[2] DI FUSCO M, FEDERICO R, BOFFI A,etal. Characterization and application of a diamine oxidase from Lathyrus sativus as component of an electrochemical biosensor for the determination of biogenic amines in wine and beer [J]. Anal Bioanal Chem, 2011,401(2):707-716.

[3] PAPAVERGOU E J, SAVVAIDIS I N, AMBROSIADIS I A. Levels of biogenic amines in retail market fermented meat products [J]. Food Chem, 2012,135(4):2750-2755.

[4] KUNG H F, LEE Y C, HUANG Y R,etal. Biogenic amines content, histamine-forming bacteria, and adulteration of pork and poultry in tuna dumpling products [J]. Food Control, 2010,21(7):977-982.

[5] ZHONG J J, YE X Q, FANG Z X,etal. Determination of biogenic amines in semi-dry and semi-sweet Chinese rice wines from the Shaoxing region [J]. Food Control, 2012,28(1):151-156.

[7] HU Y, HUANG Z Y, LI J,etal. Concentrations of biogenic amines in fish, squid and octopus and their changes during storage [J]. Food Chem, 2012,135(4):2604-2611.

[8] CARELLI D, CENTONZE D, PALERMO C,etal. An interference free amperometric biosensor for the detection of biogenic amines in food products [J]. Biosens Bioelectron, 2007,23(5):640-647.

[9] NICULESCU M, NISTOR C, FRéBORT I,etal. Redox hydrogel-based amperometric bienzyme electrodes for fish freshness monitoring [J]. Anal Chem, 2000,72(7):1591-1597.

[10] TELSNIG D, TERZIC A, KRENN T,etal. Development of a voltammetric amine oxidase-modified biosensor for the determination of biogenic amines in food [J]. Int J Electrochem Sci, 2012,7(8):6893-6903.

[11] PING J F, WU J, FAN K,etal. An amperometric sensor based on Prussian blue and poly (o-phenylenediamine) modified glassy carbon electrode for the determination of hydrogen peroxide in beverages [J]. Food Chem, 2011,126(4):2005-2009.

[12] CHEN X J, CHEN Z X, TIAN R,etal. Glucose biosensor based on three dimensional ordered macroporous self-doped polyaniline/Prussian blue bicomponent film [J]. Anal Chim Acta, 2012,723:94-100.

[13] SHAN C S, YANG H F, HAN D X,etal. Graphene/AuNPs/chitosan nanocomposites film for glucose biosensing [J]. Biosens Bioelectron, 2010,25(5):1070-1074.

[14] ZHANG M G, GORSKI W. Amperometric ethanol biosensors based on chitosan-NAD+-alcohol dehydrogenase films [J]. Electroanalysis, 2011,23(8):1856-1862.

[15] ALONSO-LOMILLO M A, DOM NGUEZ-RENEDO O, MATOS P,etal. Disposable biosensors for determination of biogenic amines [J]. Anal Chim Acta, 2010,665(1):26-31.

(編輯 楊春明)

An Amperometric Biosensor for Biogenic Amines Based on Prussian Blue/Diamine Oxidase Modified Glassy Carbon Electrode

XIAOYan-hua,SHINi,WANGJun-li,CHUMi,MAMing,XIEQing-ji,TANYue-ming*,SUXiao-li*

(Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research (Ministry of Education), College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

An amperometric biosensor was fabricated by immobilizing diamino oxidase on the surface of Prussian blue-modified glassy carbon electrode with chitosan and glutaraldehyde. The electrochemical properties of the biosensor and experimental conditions were investigated. At optimized experimental conditions, the amperometric response of the biosensor was correlated to the histamine concentration in the range of 0.33 μmol/L to 3.3 mmol/L (3.7×10-2～3.7×102mg/L) with a detection limit (S/N=3) of 0.05 μmol/L (6 μg/L). The biosensor was characterized by its wide response range, high sensitivity, good selectivity, simplicity, and rapid speed.

biogenic amines; diamine oxidase; Prussian blue; amperometric biosensor

2013-06-06

國家自然科學基金資助項目(20975038；21275052)

*

,E-mailtanyueming0813@126.com;xsu@hunnu.edu.cn

O641.2

A

1000-2537(2014)01-0037-05