DR5上調(diào)在5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素增強TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡中的作用

謝朝暉，全梅芳，曹建國，張堅松

(湖南師范大學醫(yī)學院，中國 長沙 410013)

DR5上調(diào)在5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素增強TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡中的作用

謝朝暉，全梅芳，曹建國，張堅松*

(湖南師范大學醫(yī)學院，中國 長沙 410013)

目的：觀察5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素(AFMC) )是否協(xié)同腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導人肺腺癌A549細胞凋亡．并探討其機制是否涉及死亡受體5(DR5)的上調(diào)．方法體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞和人胚肺WI-38細胞．碘化丙啶(PI)染色流式細胞術(FCM)定量分析細胞凋亡率；DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察細胞DNA梯形條帶；WesternBlotting檢測DR5蛋白表達．結果單獨用亞毒性濃度的AFMC(1.0μmol/L) 或TRAIL(30μg/L)處理A549細胞，細胞凋亡率不超過5%．AFMC(1.0μmol/L)聯(lián)合TRAIL(30μg/L)的A549細胞凋亡率增高(37.80%,P<0.01)；而WI-38細胞僅有極少量的細胞凋亡(P>0.05)．DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：兩者合用A549細胞呈現(xiàn)典型的DNA梯形條帶圖譜，而WI-38細胞未出現(xiàn)DNA梯形條帶；WesternBlotting分析發(fā)現(xiàn)：AFMC呈濃度和時間依賴性上調(diào)A549細胞DR5的表達，DR5特異性抑制劑DR5/Fc嵌合蛋白能有效降低兩者合用誘導的A549 細胞凋亡率(P<0.05)．然而，AFMC對WI-38細胞DR5表達無明顯影響．結論亞毒性濃度的AFMC選擇性增強TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡．其機制可能與其上調(diào)DR5表達有關．

肺癌；5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；死亡受體5；細胞凋亡

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 及其受體(“死亡”受體：DR4和DR5)屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，它具有選擇性誘導多種腫瘤細胞及轉化細胞凋亡，而對正常細胞沒有明顯細胞毒性的生物學特點，成為了一種極具發(fā)展?jié)摿蛻们熬暗哪[瘤靶向治療因子．但有研究證實，超過50%的腫瘤細胞對TRAIL不敏感[1]．慶幸的是，越來越多的實驗結果表明TRAIL 與化療或放療藥物聯(lián)合治療能克服大多數(shù)腫瘤細胞對TRAIL 的耐受并獲得協(xié)同殺傷效應[2]．

白楊素(5,7-二羥基黃酮，ChR)是從多種植物、蜂膠和蜂蜜中提取的一種具有廣泛生物活性的天然食源性黃酮．有研究報道指出：白楊素對非小細胞肺癌、惡性膠質瘤、子宮頸癌、白血病、食道鱗癌等多種腫瘤細胞具有良好的抗增殖活性和凋亡誘導作用，而對正常細胞未見明顯毒性[3]．但由于其腸道吸收甚少且5,7位羥基易被迅速糖基化代謝，導致該化合物的生物利用度降低，體內(nèi)活性較低，因此，其應用受到限制[4]．為此，作者以ChR為先導化合物，通過化學修飾得到ChR類似物5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素(5-allyl-7-gen-difluoromethoxy chrysin，AFMC)．在前期研究中，作者證明AFMC具有較ChR更強的誘導人肝癌HepG2細胞[5]、人卵巢癌CoC1細胞[6]、人肺癌A549細胞[7]凋亡作用．

Ding等[8]證實白楊素能通過下調(diào)c-FLIP，上調(diào)TRAIL-R2(DR5)增強TRAIL介導的白血病ATL、乳腺癌MDA-MB-231、結腸癌HT-29、肝細胞癌HepG2、黑色素瘤細胞SK-MEL-37、胰腺癌Capan-1等多種惡性腫瘤細胞凋亡．Jin等[9]報道白楊素類似物柚皮素通過上調(diào)DR5增強非小細胞肺癌A549細胞TRAIL耐藥株對TRAIL的敏感性．本文研究亞細胞毒濃度的AFMC是否通過上調(diào)DR5表達，增強TRAIL誘導的A549細胞凋亡．

1 材料和方法

1.1 試劑

5-烯丙基-7-二氟甲氧基白楊素(AFMC)按照文獻[10]方法合成,分子式：C19O4H14F2；相對分子質量：344,性狀：淡黃色晶體；純度：99.0%．白楊素(ChR)和碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品；重組人可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)由PeproTech公司生產(chǎn)；DNA Ladder檢測試劑盒購于北京博大泰克公司；重組人DR5/Fc嵌合蛋白購自R&D Systems (Minneapolis,MN)．

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺癌A549細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢)；人胚肺WI-38細胞購自中國科學院細胞庫(中國上海)．在37 ℃、5% CO2(體積分數(shù)，下同)及飽合濕度條件下，用含10%小牛血清，1.667 mkat/L(即105U/L)青霉素及1.667 mkat/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞用于各項實驗．

1.3 流式細胞術分析

取對數(shù)生長期細胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基處理24 h進行細胞周期同步化后，分別加入含AFMC (1.0 μmol/L)、TRAIL(30 μg/L)以及兩者合用的完全培養(yǎng)基孵育24 h；0.2% DMSO作為溶媒對照．收集細胞，加入PBS制備單細胞懸浮液, 再用冷卻的PBS沖洗2次, 用70%酒精4 ℃ 固定24 h, PI染色后用流式細胞儀(American BD Company, FACS420)檢測細胞凋亡．

1.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳

收集各組細胞，PBS洗滌2次，按照DNA Ladder Detection Kit說明書操作，提取細胞DNA， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段．

1.5 Western Blotting分析

收集不同處理組細胞，PBS洗滌3次，用細胞裂解液(0.1 mol/L NaCl, 0.01 mol/L Tris-cl(pH 7.6), 0.001 mol/L EDTA(pH 8.0), 1 mg/L Aprotinin, 100 mg/L PMSF)裂解細胞后提取細胞總蛋白．每組取25 μg蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳(100 mA, 3 h)，轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，然后分別加入1∶1 000稀釋的DR5(p48)和β-actin一抗，37 ℃孵育2 h；TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加入相應的二抗室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次15 min．ECL化學發(fā)光，顯影，定影．實驗中以β-actin作為內(nèi)參照蛋白．

圖1 AFMC與TRAIL及兩者合用對A549細胞與WI-38細胞凋亡率的影響(a. 0.2%DMSO;b. 1.0 μmol/L AFMC;c. 30 μg/L TRAIL;d. AFMC+TRAIL) 與溶媒組比較,aP<0.01；與單用相同濃度的AFMC或TRAIL處理組比較, bP<0.01．Fig.1 Effects of AFMC and TRAIL or in combination on the apoptotic rate in A549 cells and WI-38 cells (a. 0.2%DMSO;b. 1.0 μmol/L AFMC;c. 30 μg/L TRAIL;d. AFMC+TRAIL)aP<0.05 vs vehicle group; bP<0.01 vs the group with AFMC or TRAIL

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 亞毒性濃度的AFMC、TRAIL及兩者合用對人肺癌A549細胞凋亡的影響

PI染色FCM分析顯示：1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL單用以及兩者合用的A549細胞凋亡率(Sub-G1細胞百分率)分別為2.53%±0.35%，2.69%±0.52%，37.80%±1.78%．兩者合用的細胞凋亡率是各自單用時細胞凋亡率之和的7.2倍(P<0.05,圖1)．A549細胞凋亡率在兩者合用12 h后開始增加，24 h達高峰(圖2)．提示亞毒性濃度的AFMC能增敏TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡．

圖2 AFMC和TRAIL合用不同時間對A549細胞凋亡率的影響(FCM分析)Fig.2 Effect of AFMC in combination with TRAIL on the apoptotic rate in A549 cells at different time points (FCM results)

2.2 亞毒性濃度的AFMC、TRAIL及兩者合用對人肺癌A549細胞DNA斷裂的影響

DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示： 1.0 μmol/L AFMC或30 μg/L TRAIL分別作用于人肺癌A549細胞24 h，未見凋亡特異性的DNA梯形條帶，而1.0 μmol/L AFMC預孵育30 min后，再加入30 μg/L TRAIL處理24 h，展現(xiàn)典型DNA梯形條帶圖譜(圖3A)．進一步證實：亞毒性濃度的AFMC具有增強TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡作用．

圖3 AFMC與TRAIL及兩者合用對人肺癌A549細胞和人胚肺WI-38細胞DNA斷裂的影響Fig.3 Effects of AFMC and TRAIL or in combination on DNA fragmentation in A549 cells and WI-38 cells

2.3 AFMC對人肺癌A549細胞DR5蛋白表達的影響

Western Blotting分析表明：AFMC以濃度和時間依賴方式上調(diào)A549細胞DR5蛋白表達，DR5表達在AFMC作用6 h后開始增加，先于AFMC和TRAIL兩者合用12 h后引起的細胞凋亡率增加(圖4A，圖5)．

圖4 不同濃度AFMC對A549細胞和WI-38細胞DR5蛋白表達的影響(n=3)與溶媒組比較, aP<0.05．Fig.4 Effects of AFMC of different concentrations on the DR5 expression in A549 cells and WI-38 cells(n=3)aP<0.05 vs vehicle group.

2.4 DR5拮抗性抗體對AFMC增強TRAIL誘導人肺癌A549細胞凋亡作用影響

DR5拮抗性抗體DR5/Fc嵌合蛋白能使亞毒性濃度AFMC和TRAIL合用的A549細胞凋亡率從37.80%±1.78%下降至7.61%± 0.32%(P<0.05，圖6)，表明AFMC上調(diào)DR5表達是其增敏作用的機制之一．

2.5 AFMC、TRAIL及兩者合用對人胚肺WI-38細胞的影響

1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL分別單用或兩者聯(lián)合處理人胚肺WI-38細胞，其細胞凋亡率與溶媒組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖1)．AFMC、TRAIL無論單用或合用于WI-38細胞24 h，均未呈現(xiàn)凋亡特異性的DNA梯形條帶(圖3B)．AFMC對WI-38細胞DR5表達無明顯影響(圖4B)．說明：亞毒性濃度的AFMC 對TRAIL誘導凋亡的增敏作用具有肺癌細胞選擇性，與其選擇性上調(diào)肺癌細胞DR5 表達有關．

圖5 AFMC作用不同時間對A549細胞DR5蛋白表達的影響(n=3) 與0 h組比較 aP<0.05．Fig.5 Effects of AFMC on the DR5 expression in A549 cells at different time points(n=3)aP<0.05 vs vehicle group.

圖6 DR5/Fc嵌合蛋白對AFMC和TRAIL合用誘導A549細胞凋亡作用的影響與溶媒組比較, aP<0.05；與AFMC、TRAIL合用組比較, bP<0.05．Fig.6 Effects of DR5/Fc on the apoptosis induction of AFMC in combination with TRAIL in A549 cellsaP<0.05 vs vehicle group; bP<0.05 vs the combined group.

3 討論

肺癌系全世界最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有100～130萬患者死于肺癌.我國衛(wèi)生部2008年4月29日公布的第三次全國居民死亡原因調(diào)查顯示，過去30年間我國肺癌死亡率上升了465%，肺癌已位居我國惡性腫瘤死亡率之首．其中約80%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)，NSCLC發(fā)病隱匿，早期不易診斷，確診時多為中、晚期，已喪失手術良機．目前治療NSCLC的藥物因其非選擇性殺傷作用和較強的毒副反應，臨床應用受限．臨床仍采取以化療為主的綜合治療，但5年生存率仍低于15%，并且極易復發(fā)、轉移[11]．尋求高效、低毒的新型抗肺癌藥物是當前腫瘤防治研究的熱點．

TRAIL是1995年發(fā)現(xiàn)的與FasL和TNF-α有較高同源性的TNF超家族成員．它們都能與靶細胞膜上特異性DR4和DR5受體結合，通過多種死亡信號轉導途徑誘導靶細胞凋亡．與TNF、FASL不同，TRAIL能選擇性誘導腫瘤細胞、轉化細胞、病毒感染細胞凋亡，而對肝細胞、骨髓細胞等正常細胞幾乎無毒性．大量臨床前實驗證實TRAIL能有效地誘導多種腫瘤細胞系凋亡[12]．然而隨著研究的深入，越來越多的腫瘤細胞尤其是一些惡性腫瘤對TRAIL存在先天性或獲得性耐受[2]．如何有效逆轉腫瘤細胞對TRAIL的凋亡抵抗是當前亟待解決的問題．研究表明，細胞表面DR4和DR5的表達水平是決定腫瘤細胞對TRAIL敏感性的關鍵，而且在正常37 ℃的生理條件下， TRAIL與其受體結合，DR5的親和力最強，從而在TRAIL誘導的凋亡通路中發(fā)揮最大作用[13]．如何上調(diào)DR尤其是DR5的表達，增強腫瘤細胞的TRAIL敏感性，充分發(fā)揮TRAIL的選擇性殺傷效應成為近年研究的熱點．

作者前期研究通過細胞毒實驗確定了AFMC和TRAIL的亞毒性(細胞毒性<15%)濃度，證實人肺癌A549細胞對TRAIL耐藥且AFMC能選擇性增強TRAIL對A549細胞毒作用[14]．那么，這種細胞毒增敏效應是否通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)？本文通過FCM分析和瓊脂糖凝膠電泳證明，亞毒性濃度的AFMC與TRAIL聯(lián)用能協(xié)同誘導A549細胞凋亡．文獻報道[8]，白楊素能通過上調(diào)DR5表達增強TRAIL對多種惡性腫瘤的凋亡誘導作用．前期研究中，作者發(fā)現(xiàn)不同濃度AFMC對A549細胞DR4的表達未見明顯影響．Western Blotting檢測AFMC呈濃度和時間依賴方式上調(diào)DR5表達．DR5拮抗性抗體DR5/Fc嵌合蛋白能使AFMC和TRAIL合用的A549細胞凋亡率顯著下降．提示DR5的表達上調(diào)是AFMC增敏TRAIL誘導A549細胞凋亡的機制之一．前期研究表明AFMC和TRAIL合用對永生化二倍體人胚肺WI-38細胞無明顯細胞毒性，本文同樣證實了兩者合用對WI-38細胞無明顯凋亡誘導作用，且AFMC對WI-38細胞DR5表達無影響．綜合以上結果作者推測：AFMC選擇性增敏TRAIL 誘導人肺癌A549細胞凋亡，與其上調(diào)DR5 表達有關．關于AFMC如何上調(diào)DR5的具體機制仍有待深入研究和探討．本文結果可為將天然食源性黃酮化學改造，開發(fā)基于TRAIL抗腫瘤治療提供新途徑．

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(編輯 王 健)

Role of DR5 Upregulation on 5-Allyl-7-Gen-Difluoromethoxy-Chrysin Sensitizing TRAIL-Induced Apoptosis in Human Lung Cancer A549 Cells

XIEZhao-hui,QUANMei-fang,CAOJian-guo,ZhangJian-song*

(Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Aim: To investigate the synergistic action of 5-allyl-7-gen-difluoromethoxychrysin(AFMC) combined with Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) in apoptosis of human lung cancer A549 cell line and explore whether the potential internal mechanism is refered to the up-regulation of DR5 protein.MethodsHuman lung cancer A549 cells and human immortalized embryonic lung WI-38 cells were cultured in vitro. Cell apoptotic rate was determined by flow cytometry ( FCM ) using PI staining. DNA ladder bands were observed by DNA agarose gel electrophoresis. The expression of DR5 protein was analyzed using Western blotting.ResultsFlow cytometry (FCM) analysis indicated that the apoptosis rate of A549 cells by 1.0 μmol/L AFMC(at suboptimal concentrations) or 30 μg/L TRAIL alone were less than 5%. Combined treatment of A549 cells with AFMC and TRAIL, the apoptosis rate significantly increased(37.80%,P<0.01). But the same treatment to WI-38 cells had no apparent effect(P>0.05). The typical ladder bands could be shown in DNA agarose gel electrophoresis in A549 cells but not in WI-38 cells by the combined use of AFMC and TRAIL .Western blotting analysis indicated that AFMC markedly induced the expression of death receptor 5 (DR5) in A549 cells, in a time-and concentration-dependent manner. DR5/Fc chimera protein, a specific inhibitor for DR5, could dramatically reduce the apoptotic rate of A549 cells by the combination of AFMC and TRAIL(P<0.05). On the other hand, AFMC-mediated induction of DR5 expression is not observed in WI-38 cells.ConclusionAFMC at subtoxic concentration selectively enhances susceptibility to TRAIL-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells through up-regulating DR5 expression.

lung cancer; 5-allyl-7-gen-difluoromethoxy-chrysin; TNF-related apoptosis-inducing ligand; DR5; apoptosis

2013-03-02

湖南省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(B2010-104); 湖南省教育廳重點資助項目(11A073);湖南省科技廳科研基金資助項目(2010SK3008)

*

,E-mailjwc_zjs@126.com

R966

A

1000-2537(2014)01-0022-06