四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及血管內(nèi)皮生長因子的影響

高 慧 劉 真 于慧卿 付 達(dá) 郭 娜

(河北省石家莊市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及血管內(nèi)皮生長因子的影響

高 慧 劉 真 于慧卿 付 達(dá) 郭 娜

(河北省石家莊市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的觀察四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平的影響。方法將HUVEC細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，將實驗用細(xì)胞分為3組，正常組、模型組、四妙勇安湯組。正常組將正常的HUVEC細(xì)胞加入正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組將HUVEC細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理后加入正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；四妙勇安湯組將HUVEC細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理后加入含10%四妙勇安湯醇沉藥液的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組IL-6、TNF-α水平，用免疫組化法檢測各組VEGF生成量的表達(dá)。結(jié)果模型組、四妙勇安湯組IL-6、TNF-α及VEGF水平與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IL-6、TNF-α上升，VEGF下降；但四妙勇安湯組IL-6、TNF-α上升水平及VEGF下降水平均小于模型組(P<0.01)，四妙勇安湯可以改善缺氧HUVEC細(xì)胞中IL-6、TNF-α及VEGF水平變化。結(jié)論四妙勇安湯對缺氧HUVEC細(xì)胞能有效地抑制炎性因子的分泌，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有抗炎及促進(jìn)血管新生的作用，對損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

四妙勇安湯；臍靜脈；內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧；炎癥趨化因子類

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)是介導(dǎo)機體非特異性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，與心血管疾病關(guān)系密切[1-2]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素，其損傷可致多系統(tǒng)功能障礙[3]。自1986年由Ross提出了動脈粥樣硬化病發(fā)生的慢性炎癥假說以來[4]，炎癥反應(yīng)與缺血再灌注損傷的密切關(guān)系已成為共識[5]?，F(xiàn)代學(xué)者研究表明，四妙勇安湯具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，對冠心病以及急性心肌梗死患者有確切的療效[6]。本研究將從IL-6、TNF-α及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)3個不同方面觀察四妙勇安湯對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的影響，以研究四妙勇安湯對血管缺血灌注損傷的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 1640培養(yǎng)基干粉，美國Invitrogen Gibco 公司；胰蛋白酶，美國Amersco公司；兔抗人第八因子相關(guān)抗原多克隆抗體(產(chǎn)品編號bs-0332R)、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、VEGF，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG多克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；人TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)定量檢測試劑盒、人IL-6 ELISA定量檢測試劑盒，上海森雄科技實業(yè)有限公司；人HUVEC細(xì)胞株，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；馬血清，上海北諾生物科技有限公司；緩沖甘油，10%福爾馬林液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，Earle's平衡鹽溶液(EBS)。

1.2 儀器設(shè)備 DL-CJ-1N型無菌實驗臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Revco公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；一次性塑料培養(yǎng)瓶、一次性6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Costar公司；芬蘭雷勃MK3酶標(biāo)儀，上海雷勃生物技術(shù)有限公司；SHA-B水浴恒溫微量振蕩器，常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HUVEC的傳代和培養(yǎng) 將HUVEC細(xì)胞株采用胰酶消化法傳代，收集第4代HUVEC細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，使細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)1×105cells/cm2，然后分裝在24孔培養(yǎng)皿中，放入37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日換液1次，1周后長成單層細(xì)胞供實驗用。

1.3.2 內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧模型的建立 將傳代培養(yǎng)的第4代HUVEC細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孔底預(yù)先鋪有明膠包被過的蓋玻片，待融合成完整細(xì)胞單層后棄去原培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2次，加入EBS 3 mL，輕輕的將無菌石蠟油600 μL滴入EBS液，使其完整覆蓋于EBS液表面，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[7]。同時設(shè)未加石蠟油的標(biāo)本為正常對照組。

1.3.3 四妙勇安湯醇沉藥液的制備 按原方稱取中藥(金銀花90 g，玄參90 g，當(dāng)歸60 g，甘草30 g)，當(dāng)歸粉碎為粗末，加10倍的70%乙醇浸泡24 h，滲漉，揮干乙醇，約80 mL，備用。金銀花、玄參、甘草加水煎煮2次，每次10倍量水，30 min，合并煎液，濃縮至200 mL，放冷，加入95%乙醇至含醇量75%，靜置24 h，濾取藥液，揮干乙醇，濃縮至150 mL，加入當(dāng)歸液，微熱至125 mL，每1 mL相當(dāng)于2 g藥材。

1.3.4 實驗分組 四妙勇安湯組：缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中加入含10%四妙勇安湯醇沉藥液的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。模型組：缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中加入正常1640培養(yǎng)液，放入37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。正常組：正常細(xì)胞加入正常1640培養(yǎng)液，放入37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組均設(shè)置10個復(fù)孔。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 ELISA法測定IL-6含量 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，實驗前20 min從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫(20～25 ℃)。將細(xì)胞接種于96孔板上，參照上述缺氧模型及實驗分組分別進(jìn)行實驗，每組均設(shè)10個復(fù)孔。每孔中各加入樣品稀釋液100 μL，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復(fù)做對倍稀釋至第9孔，最后從第9孔中吸出100 μL棄去，使之容積均為100 μL。第10孔為空白對照。待測品孔中每孔各加入待測樣品100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃，120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔中加入第1抗體工作液50 μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃，60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。將反應(yīng)板置37℃，60 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min。每孔加入50 μL終止液混勻。在492 nm處測吸光值，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出相應(yīng)IL-6含量。

1.4.2 ELISA法測定TNF-α含量 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，實驗前20 min從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫(20～25℃)。將細(xì)胞接種于96孔板上，參照上述缺氧模型及實驗分組分別進(jìn)行實驗，每組均設(shè)10個復(fù)孔。每孔中各加入樣品稀釋液100 μL，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復(fù)做對倍稀釋至第9孔，最后，從第9孔中吸出100 μL棄去，使之容積均為100 μL。第10孔為空白對照。待測品孔中每孔各加入待測樣品100 μL，將反應(yīng)板置37 ℃，120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔中加入第1抗體工作液(兔抗人第八因子相關(guān)抗原多克隆抗體，1∶100稀釋)50 μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃，60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。將反應(yīng)板置37 ℃，60 min。洗板同前。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min。每孔加入50 μL終止液混勻。在492 nm處測吸光值，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出相應(yīng)TNF-α含量。

1.4.3 免疫組化法測定VEGF生成量 取出各組10孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中蓋玻片，PBS輕輕沖洗3次，每次持續(xù)約1 min。用10%福爾馬林液室溫固定10 min，PBS輕輕沖洗3次，每次持續(xù)約1 min。10%馬血清70 μL室溫封閉20 min，加入第1抗體(兔抗人第八因子相關(guān)抗原多克隆抗體，1∶100稀釋)70 μL，37℃孵育1 h，同時用PBS代替第1抗體作為對照組。PBS輕輕沖洗3次，每次持續(xù)約1 min，加入生物素標(biāo)記的第2抗體(羊抗兔IgG多克隆抗體，1∶400稀釋)70 μL，37 ℃孵育30 min，PBS輕輕沖洗3次，每次持續(xù)約1 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS輕輕沖洗3次，每次持續(xù)約1 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗。復(fù)染，脫水，透明，封片。并于10×40顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

3組對缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF表達(dá)的影響比較見表1。

表1 3組對缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF表達(dá)的影響比較

與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

由表1可見，模型組、四妙勇安湯組IL-6、TNF-α及VEGF水平與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IL-6、TNF-α上升，VEGF下降；但四妙勇安湯組IL-6、TNF-α上升水平及VEGF下降水平均小于模型組(P<0.01)，四妙勇安湯可以改善缺氧HUVEC中IL-6、TNF-α及VEGF水平變化。

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)血管張力，維持凝血和纖溶系統(tǒng)之間的平衡，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的聚集，抑制血小板的聚集和活性等作用[8]，它可分泌多種細(xì)胞因子，參與組成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。血管內(nèi)皮細(xì)胞和冠心病的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系，其功能障礙是冠心病發(fā)病的始動環(huán)節(jié)[9]。四妙勇安湯最早見于華佗《神醫(yī)秘傳》，清代醫(yī)家鮑相敖將此方命名為“四妙勇安湯”，收載于《驗方新編》中，其功效為清熱解毒，活血止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，本方能促進(jìn)血液循環(huán)，使冠狀動脈擴張，側(cè)支循環(huán)增多，從而減輕冠脈缺氧缺血，增加心肌收縮力，改善癥狀[10]。

IL-6是機體免疫、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的主要分子，與炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)有關(guān)。lL-6在缺血區(qū)、缺血周圍區(qū)均有表達(dá)，且以缺血周圍區(qū)最為明顯，再灌注24 h后表達(dá)最高，并在缺血再灌注損傷后期仍維持較高水平[11]。研究表明，在冠脈粥樣硬化斑塊局部和粥樣硬化損傷的動脈壁上均發(fā)現(xiàn)有IL-6的表達(dá)，且表達(dá)量是正常組織的10～40倍[12]。IL-6參與冠脈粥樣硬化的形成與進(jìn)展的途徑為：①加速脂質(zhì)沉積，促進(jìn)粥樣斑塊形成；②促進(jìn)冠脈血栓形成；③參與斑塊的形成；④促進(jìn)炎癥反應(yīng)；⑤導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定破裂。本實驗結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，IL-6的表達(dá)明顯升高；四妙勇安湯組與模型組相比，IL-6的表達(dá)明顯降低，但仍高于正常組水平。因此，推測四妙勇安湯可以影響炎癥因子，抑制炎癥反應(yīng)，有穩(wěn)定斑塊作用。

TNF-α是由被激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的一種可溶性多肽類細(xì)胞因子。心臟巨噬細(xì)胞是TNF-α的重要來源，是免疫和炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[13]。TNF-α可促進(jìn)動脈粥樣斑塊形成、擴大，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血小板激活因子，還對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生直接細(xì)胞毒作用，破壞其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，促進(jìn)炎性介質(zhì)分泌，參與血管平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控，使血管壁增厚，管腔狹窄[14]。本實驗結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，TNF-α表達(dá)明顯升高；與模型組相比，加入四妙勇安湯醇沉藥液后TNF-α表達(dá)明顯降低。因此，推斷四妙勇安湯可以抑制炎癥反應(yīng)，從而對血管缺血損傷具有保護(hù)作用。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，具有增加微血管與小靜脈血管的通透性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成等作用[15]，可提高內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡能力，促內(nèi)皮損傷修復(fù)，防止血小板黏附和血栓形成，還有增加血管通透性和舒張冠脈的作用[16]。本實驗結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，VEGF的表達(dá)數(shù)量明顯減少；四妙勇安湯組與模型組相比，VEGF的表達(dá)數(shù)量明顯升高。因此，推測四妙勇安湯可以增加VEGF的生成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的合成，以使側(cè)支循環(huán)建立，血管新生，保護(hù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，本實驗通過建立體外HUVEC缺氧模型，并在此基礎(chǔ)上從IL-6、TNF-α的分泌量及VEGF生成量3個不同方面觀察四妙勇安湯對缺氧HUVEC的影響，結(jié)果表明四妙勇安湯能有效地抑制炎性因子的分泌，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有抗炎及促進(jìn)血管新生的作用，從而可發(fā)揮中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)、多靶點的作用特點，為四妙勇安湯臨床治療應(yīng)用提供了部分實驗依據(jù)。

[1] 王易，楊躍進(jìn).細(xì)胞因子在冠心病中的作用研究進(jìn)展[J].中華心血管病雜志，2003，31(12):950-952.

[2] Kimura T，Kanda T，Kotajima N，et al.Involvement of circulating interleukin-6 and its receptor in the development of euthyroid sick syndrome in patients with acute myocardial infarction[J].Eur J Endocrinol，2000，143(2):179-184.

[3] 李曉，丁書文.心和顆粒劑保護(hù)冠心病患者血管內(nèi)皮損傷的臨床研究[J].中醫(yī)雜志，2000，41(11):661-663.

[4] Ross R.Atherosclerosis--an inflammatory disease[J].N Engl J Med，1999，340(2):115-126.

[5] Frangogiannis NG，Smith CW，Entman ML.The inflammatory response in myocardial infarction[J].Cardiovasc Res，2002，53(1):31-47.

[6] 尤寅駿，張建忠.四妙勇安湯臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，37(7):942-944.

[7] 艾珣，顧玉東.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞慢性缺血缺氧模型[J].中華手外科雜志，2001，17(4):233-236.

[8] 邱雅慧.血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及損傷修復(fù)與動脈粥樣硬化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(10):1927-1929.

[9] 錢學(xué)賢，戴玉華，孔華宇.現(xiàn)代心血管病學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，1999：843.

[10] 杜志剛，姜鴻雁.加味四妙勇安湯治療腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊療效觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(3):393-394.

[11] 張金，李陽，魏利華.高血壓大鼠局灶性腦缺血再灌注后IL-6mRNA在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2005，12(2):107-110.

[12] Seino Y，Ikeda U，Ikeda M，et al.Interleukin 6 gene transcripts are expressed in human atherosclerotic lesions[J].Cytokine，1994，6(1):87-91.

[13] Kapadia S，Lee J，Torre-Amione G，et al.Tumor necrosis factor-alpha gene and protein expression in adult feline myocardium after endotoxin administration[J].J Clin Invest，1995，96(2):1042-1052.

[14] 梁偉鈞，符益冰，陳建英.冠心病患者血漿內(nèi)皮素和腫瘤壞死因子含量變化及其臨床意義[J].心臟雜志，2003，15(2):137-138.

[15] Zachary I，Mathur A，Yla-Herttuala S，et al.Vascular protection：A novel nonangiogenic cardiovascular role for vascular endothelial growth factor[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20(6):1512-1520.

[16] Ku DD，Zaleski JK，Liu S，et al.Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries[J].Am J Physiol，1993，265(2 Pt 2):H586-H592.

(本文編輯：石 康)

InvestigationofSimiaoyong'andecoctiononIL-6,TNF-αandVEGFinhumanumbilicalveinendothelialcellswithanoxia

GAOHui,LIUZhen,YUHuiqing,etal.

VasculocardiologyDepartment,ShijiazhuangHospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,Hebei,Shijiazhuang050051

ObjectiveTo investigate the effect of Simiaoyong'an decoction on IL-6, TNF-αand VEGF in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with anoxia.MethodsHuman umbilical vein endothelial (HUVEC) cell lines were subcultured.The cells were divided into three experimental groups, the normal group, model group, Simiaoyong'an decoction group.The normal HUVEC in the normal group were cultured in normal culture solution.HUVEC in model group

anaerobic treatment and then were cultured by normal culture solution.HUVEC in Simiaoyong'an decoction group received anaerobic treatment and then were cultured by 10% Simiaoyong'an decoction culture solution.The levels of IL-6, TNF-a and VEGF were measured by ELISA and immunohistochemistry in each group.ResultsThere were significant differences between model group, Simiaoyong'an decoction group and the normal group on the levels of IL-6, TNF-a and VEGF (P<0.01).The levels of IL-6 and TNF-αwas increased, and VEGF was decreased.But the increase of IL-6 and TNF-αand the decrease of VEGF in Simiaoyong'an decoction group was less than that in model group (P<0.01).Simiaoyong'an decoction can improve the levels of IL-6, TNF-a and VEGF in HUVEC with anoxia.ConclusionSimiaoyong'an decoction can effectively inhibit the secretion of inflammatory factors in human umbilical vein endothelial cells with anoxia, promote the proliferation of endothelial cells, have anti-inflammatory and angiogenic effects on vascular endothelial cell injury has a protective effect.

Simiaoyong'an decoction; Umbilical vein; Endothelial cell; Anoxia; Chemokines

高慧(1976—)，女，副主任醫(yī)師，碩士。從事心血管內(nèi)科臨床及科研工作。

R285.5

A

1002-2619(2014)06-0898-04

2013-08-08)