缺氧缺血性腦病新生大鼠腎臟Bax和Caspase-3蛋白的表達與腎細胞凋亡的作用機制

劉釗 李易明 王冀 王蕾 李文建

·論著·

缺氧缺血性腦病新生大鼠腎臟Bax和Caspase-3蛋白的表達與腎細胞凋亡的作用機制

劉釗 李易明 王冀 王蕾 李文建

目的探討缺氧缺血性腦病(HIE)新生大鼠腎臟Bax和Caspase-3蛋白的表達與腎細胞凋亡的作用機制。方法新生7 d Wistar大鼠制備HIE模型。分為假手術對照組和HIE組，于HIE后6、12、24和48 h處死大鼠，取腎臟組織，應用流式細胞術檢測腎細胞凋亡情況；應用免疫組織化學法檢測腎細胞Bax和Caspase-3蛋白的表達情況；ELISA法檢測TNF-α、IL-1β的分泌；應用Western blot技術檢測腎細胞凋亡與p38MAPK信號通路的關系。結果HIE組6 h腎臟陽性凋亡細胞開始增多，24 h達到高峰，各時間點陽性凋亡細胞均高于對照組(P<0.05)； HIE組12 h Bax和Caspase-3陽性細胞表達開始增多，24 h達到高峰，各時間點陽性細胞均高于對照組(P<0.05)；HIE組6 h TNF-α、IL-1β分泌開始增多，TNF-α12 h達到高峰，IL-1β 24 h達到高峰各時間點TNF-α、IL-1β均高于對照組(P<0.05)；HIE組6 hp-p38MAPK蛋白表達開始增多并達到高峰，各時間點p-p38MAPK蛋白均高于對照組(P<0.05)。結論HIE新生大鼠腎臟細胞Bax和Caspase-3蛋白表達增加，提示Bax和Caspase-3蛋白表達對腎臟細胞凋亡有促進作用，其可能通過p-p38MAPK信號通路實現的。

Bax；Caspase-3；凋亡；缺氧缺血性腦?。荒I臟細胞；p-p38MAPK

缺氧缺血性腦病是圍產期窒息導致腦組織缺氧缺血性損傷，是新生兒常見疾病，是新生兒死亡或運動、智力障礙的常見原因[1]。HIE除腦組織缺氧缺血性損傷外，全身多器官均有損傷，其中，腎臟為損傷的重要臟器之一。目前，人們對HIE造成的腦損傷研究報道較多[2，3],而對HIE發(fā)生后腎臟損傷研究較少，凋亡相關基因的表達對腎細胞凋亡的影響鮮有報道。本研究通過應用流式細胞術檢測腎細胞凋亡情況；應用免疫組織化學法檢測腎細胞Bax和Caspase-3蛋白的表達情況；ELISA法檢測TNF-α、IL-1β的分泌；應用Western blot技術檢測腎細胞凋亡與P38MAPK信號通路的關系，探討HIE新生兒腎臟損傷的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；鼠抗兔Bax和Caspase-3單抗、TNF-α、IL-1 βELISA試劑盒(美國 eBioscience公司)；蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑、p-P38和β-actin抗體(美國Sigma公司)；Western blot試劑和標準Marker(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；酶標儀(美國Invitrogen公司)；蛋白電泳(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物及分組 將生長條件相同的新生7 d Wistar大鼠，雌雄不限，共40只，隨機分為假手術對照組和HIE(6、12、24和48 h)組，每組8只。假手術對照組只予分離左側頸總動脈，不結扎動脈，縫合皮膚；HIE組分離并結扎左側頸總動脈，縫合皮膚，術后放回鼠籠恢復2 h。隨后，置于密閉玻璃器皿中，以濕化的8%氧氣和92%氮氣的混合氣體輸入玻璃器皿中，持續(xù)3～4 h制成新生大鼠HIE動物模型[4]。

1.3 標本取材 HIE后6、12、24和48 h后處死大鼠，去除腎臟包膜，沿矢狀正中線切開，將腎臟皮質分為4份，分別用于流式檢測、免疫組織化學、ELISA和Western blot檢測。

1.4 實驗方法

1.4.1 Annexin V凋亡檢測腎臟細胞凋亡情況：收集腎細胞，預冷PBS洗滌2次，懸浮細胞，調整細胞個數為1×106cells/ml，按照BD試劑盒說明書完成Annexin V-FITC/PI雙染色后，PBS洗滌后，立刻上機檢測。

1.4.2 免疫組化檢測Bax和Caspase-3蛋白的表達：腎臟石蠟包埋組織切片經脫蠟、水化、抗原修復，加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，加一抗(Bax和Caspase-3單抗)，室溫孵育1 h，加試劑A-聚合物增強劑，室溫孵育20 min，加試劑B-酶標抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min，再經DAB顯色，蘇木素襯染，脫水干燥，中性樹脂封片。

1.4.3 TNF-α、IL-1β細胞因子的檢測：將腎皮質用剪刀剪碎再用玻璃勻漿器充分勻漿，12 000 r/min，4℃，離心30 min后取上清，TNF-α、IL-1β濃度的檢測采用ELISA法，具體操作根據試劑盒說明書進行。

1.4.4 Western blot檢測P38MAPK信號通路情況：將腎臟用剪刀剪碎，按照蛋白抽提試劑盒說明加入試劑，再用玻璃勻漿器充分勻漿。12 000 r/min，4℃，離心30 min后取上清，取上清液后進行蛋白定量。制備的蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳分離，再以400 mA恒流電轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,再加入一抗4℃孵育過夜，次日TBS-T洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，10 min/次，ECL化學發(fā)光劑發(fā)光檢測信號。

2 結果

2.1 5組大鼠腎細胞凋亡的情況 結果顯示對照組陽性凋亡細胞為2.75%，HIE組6 h腎臟陽性凋亡細胞開始增多，24 h達到高峰，各時間點陽性凋亡細胞仍高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 腎細胞凋亡活性的流式細胞術檢測

2.2 5組大鼠腎臟組織Bax和Caspase-3免疫組化染色結果比較 應用免疫組化染色顯示，HIE組Bax和Caspase-3表達量明顯升高，可見大量的強陽性棕褐色顆粒，而對照組中Bax和Caspase-3的表達極低，幾乎看不到棕褐色顆粒，差異明顯(P<0.05)；在HIE后24 h Bax和Caspase-3表達達到高峰，明顯高于其他時間點，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 5組大鼠腎組織Bax蛋白表達圖像(免疫組化×400)

圖3 5組大鼠腎組織Caspase蛋白表達圖像(免疫組化×400)

2.3 ELISA測定TNF-α、IL-1β分泌水平變化 采用ELISA技術檢測5組腎細胞中的TNF-α、IL-1β的分泌。HIE組6 h TNF-α、IL-1β分泌開始增多，TNF-α 12 h達到高峰，IL-1β 24 h達到高峰，各時間點TNF-α、IL-1β的分泌均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 ELISA檢測腎組織中細胞因子分泌情況

組別對照組HIE6hHIE12hHIE24hHIE48hTNF-α20.0±2.822.8±2.9*29.8±3.2*35.2±3.9*23.9±4.0*IL-1β1.7±0.92.1±0.9*2.8±0.6*3.2±0.8*2.2±0.5*

注：與對照組比較，*P<0.05

2.4 Western blot測定p-p38MAPK信號通路的變化 HIE組p-p38MAPK蛋白表達均高于對照組，差異顯著(P<0.05)，其中HIE組中，6 hp-p38MAPK表達明顯高于其他時間段，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同組大鼠腎組織的p-p38MAPK表達

3 討論

目前國內外關于HIE神經細胞凋亡的報道較多[5，6]，但腦組織損傷后造成其他器官功能改變的機制尚不甚清楚。本實驗采用新生7 d Wistar大鼠HIE模型，通過流式細胞術檢測HIE大鼠腎細胞的凋亡情況，結果表明，假手術對照組偶見陽性凋亡細胞，HIE組，6 h陽性凋亡細胞開始增加，24 h到達頂峰，且明顯高于對照組(P<0.05)，證明HIE過程中，腎細胞存在凋亡現象。

細胞凋亡又稱細胞程序化死亡，是由多基因控制的細胞生理性、自主性的死亡過程[7]。細胞發(fā)生凋亡主要有兩種途徑：死亡受體/Fas途徑和線粒體途徑，其中Caspase-8介導死亡受體/Fas途徑，Caspase-9介導線粒體途徑，兩途徑都是由Caspase的活化而啟動的[8]。Caspase-8和Caspase-9下游分子均為Caspase-3，其是Caspase家族中最關鍵的效應蛋白酶，是發(fā)生凋亡的標志酶[9]。Caspase-9介導線粒體途徑，主要受Bcl-2家族蛋白調控，Bax屬于Bcl-2家族，為凋亡誘導蛋白。當Bax二聚體形式存在時，其在線粒體外膜形成離子通道從而改變線粒體的通透性，細胞色素C釋放，激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，促進細胞凋亡[10，11]。本實驗測定HIE 狀態(tài)下腎組織bax和Caspase-3蛋白的表達，結果表明，假手術對照組腎臟組織中bax和Caspase-3蛋白呈弱陽性，HIE組12 h開始出現較多的陽性細胞，24 h達到高峰，后緩慢降低，但仍高于對照組。將bax和Caspase-3蛋白的表達與流式細胞儀測得凋亡細胞數做相關分析，發(fā)現Bax和Caspase-3蛋白表達增加，凋亡細胞數也增加，提示在HIE模型中，通過激活Bax/Caspase-3通路誘導腎臟細胞的線粒體依賴性凋亡。

研究表明，在HIE模型中腦組織缺氧缺血后引發(fā)多種免疫細胞和免疫分子參與的炎性反應，造成免疫功能紛亂。Wixey等[12，13]研究證實，缺氧缺血后的新生鼠腦組織中 IL-1β和TNF-α水平增加。本實驗利用ELISA首先來檢測炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，結果顯示HIE組TNF-α和IL-1β的分泌均明顯高于對照組，其中在HIE組中，24 hTNF-α和IL-1β的含量要高于其他組。同時WB檢測p-p38MAPK蛋白的表達，HIE組中，6 h p-p38MAPK蛋白表達達到高峰，各時間點均高于對照組。腎組織在缺氧缺血的狀態(tài)下，IL-1β和TNF-α等炎性因子水平增加，其做為上游因子可激活MAPK家族成員[14]，如p38MAPK，其通過下游的因子激活Bax和Caspase-3蛋白，促進細胞凋亡過程，以上結果提示p38MAPK磷酸化可能有促凋亡作用。

綜上所述，研究證實在HIE新生大鼠腎細胞缺氧缺血的狀態(tài)下，能誘導炎性細胞因子的分泌增加，從而激活p-p38MAPK信號傳導通路，上調Bax和Caspase-3蛋白的表達，引起腎臟細胞凋亡，而且通過實驗所設置的時間組來看，12～24 h的Bax和Caspase-3蛋白高表達，闡明對于HIE的患者，早期診斷，早期治療有著重要意義。

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ExpressionofBaxandCaspase-3proteininkidneyofneonatalratswithhypoxic-ischemicencephalopathyaswellastheactionmechanismofapoptosisinrenalcells

LIUZhao*,LIYiming*,WANGJi,etal.*ClinicalCollegeofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo investigate the expression of Bax and Caspase-3 in kidney of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE) as well as the action mechanism of apoptosis in renal cells.MethodsHIE models were established in seven-day-old Wistar rats,then these rats were randomly divided into sham operation control group and HIE group.The rats were executed at 6h,12h,24h,48h after HIE and kidney tissues were obtained.The apoptosis condition of renal cells was detected by flow cytometry,and expression of Bax and Caspase-3 protein was determined by immunohistochemistry,the levels of TNF-αand IL-1β were detected by ELISA,and renal cells apoptosis and P38MAPK signaling pathway were examined by Western Blot.ResultsIn HIE group,positive apoptosis cells were increased at 6h and reached peak at 24h,which were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).More Bax and Caspase-3 positive cells appeared at 12h in HIE group and peaked at 24h,and positive cells in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).At 6h,the levels of TNF-αand IL-1βwere increased in HIE group,and TNF-αreached peak at 12h,however,IL-1βreached peak at 24h,and the levels of TNF-α and IL-1β in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).The expression levels of p-P38MAPK protein were increased at 6h in HIE group and reached the peak,and the expression levels of p-P38MAPK protein were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).ConclusionThe expression levels of Bax and Caspase-3 in renal cells of neonate rats with HIE are increased,which suggests that the expression of Bax and Caspase-3 contributes to the apoptosis of renal cells via p-P38MAPK signaling pathway.

Bax；Caspase-3；apoptosis；hypoxic-ischemic encephalopathy；renal cell；p-p38MAPK

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.001

050031 石家莊市，河北醫(yī)科大學臨床學院(劉釗、李易明)，教務處(王冀)，免疫教研室(李文建)；河北省保定市第一中心醫(yī)院分院(王蕾)

李文建，050017 河北醫(yī)科大學免疫教研室；

E-mail：liwenjian969@sohu.com

R 742.8

A

1002-7386(2014)11-1605-04

2013-12-11)