左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟、脂肪代謝和孤雌胚胎發(fā)育的影響

馮美瑩, 李桂煥, 徐振鵬, 白銀山, 王文聰, 李 莉, 張守全, 衛(wèi)恒習

(華南農業(yè)大學 動物科學學院/國家生豬種業(yè)工程技術研究中心/廣東省農業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642)

左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟、脂肪代謝和孤雌胚胎發(fā)育的影響

馮美瑩, 李桂煥, 徐振鵬, 白銀山, 王文聰, 李 莉, 張守全, 衛(wèi)恒習

(華南農業(yè)大學 動物科學學院/國家生豬種業(yè)工程技術研究中心/廣東省農業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642)

【目的】探討不同質量濃度的左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟、脂肪代謝和孤雌胚胎發(fā)育的影響.【方法】在成熟培養(yǎng)液中添加不同質量濃度左旋肉堿，觀察其對豬卵母細胞體外成熟和孤雌胚胎發(fā)育的影響，并利用油紅染色、三酰甘油定量試劑盒和定量RT-PCR技術檢測其對卵母細胞脂肪代謝及其關鍵水解酶表達水平的影響.【結果和結論】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉堿能極顯著促進豬卵母細胞的脂肪滴代謝(P<0.001)，并顯著提高豬卵母細胞體外成熟率和孤雌激活囊胚發(fā)育率(P<0.05)；在胚胎培養(yǎng)液中添加100 ng/mL左旋肉堿能夠顯著提高豬孤雌胚胎卵裂率(P<0.05)，其囊胚率和囊胚質量均有提高的趨勢；通過定量RT-PCR進一步發(fā)現100 ng/mL左旋肉堿極顯著降低豬卵母細胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL，P<0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL，P<0.001)的mRNA表達水平，表明左旋肉堿能夠影響調控脂肪代謝關鍵酶基因的表達.試驗結果表明，左旋肉堿具有促進豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活胚胎發(fā)育能力的作用，其可能是通過調控脂肪代謝來實現的.

豬卵母細胞； 左旋肉堿； 孤雌激活； 脂肪代謝； 胚胎發(fā)育

隨著哺乳動物體細胞核移植、轉基因和胚胎干細胞等高新生物技術的發(fā)展，人們對卵母細胞質量的要求越來越高.當前豬卵母細胞體外成熟(Invitromaturation, IVM)體系仍不完善，導致豬卵母細胞的體外成熟質量不高、胚胎發(fā)育受阻，這制約了其在科學研究和畜牧生產中的應用[1-3].研究發(fā)現，豬卵母細胞和早期胚胎中含有大量的脂肪滴，致使其對外界環(huán)境極為敏感，特別是低溫條件會造成豬胚胎發(fā)育停止或死亡[4].同時這也造成了胚胎冷凍保存的困難.

左旋肉堿是脂肪代謝過程中的一種關鍵的分子，能夠促進脂肪代謝.在細胞內，左旋肉堿作為載體把脂肪酸從線粒體膜外轉運到線粒體膜內，促使脂肪酸在線粒體內氧化分解并釋放出能量[1, 5-7].研究還發(fā)現左旋肉堿能夠有效促進卵子的體外成熟和胚胎發(fā)育[4-5, 8]，但其在豬卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育中的作用和機制尚不完全清楚.

本試驗旨在研究不同質量濃度的左旋肉堿對豬卵母細胞的體外成熟、孤雌胚胎早期發(fā)育和囊胚質量的影響及其可能的作用途徑，以期完善豬卵母細胞的體外培養(yǎng)體系，為提高豬卵母細胞和胚胎質量、促進豬胚胎冷凍保存技術的發(fā)展提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)、非必需氨基酸(MEM NEAA)、丙酮酸鈉和谷氨酰胺為GIBCO公司產品，葡萄糖為Hgclone公司產品，其他試劑均為Sigma公司產品.

試驗中所用的溶液主要成分如下：成熟培養(yǎng)液中含有TCM 199(Tissue culture medium 199)、體積分數為10%的豬卵泡液、10 ng/mL的表皮生長因子、10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素、10 IU/mL孕馬血清促性腺激素和0.1 mg/mL的L-半胱氨酸，每組再根據試驗要求添加一定質量濃度的左旋肉堿；采卵液(Polyvinyl alcohol-Dulbecco’s phosphate buffered saline, PVA-DPBS)中含有DPBS和1 g/L的聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，PVA)；電激活液中含有0.25 mol/L甘露醇，0.10 mmol/L CaCl2，0.10 mmol/L MgCl2，0.05 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.1 g/L PVA；豬胚胎培養(yǎng)液(PZM-3，porcine zygote medium 3)中含有100.00 mmol/L NaCl、25.10 mmol/L NaHCO3、10.00 mmol/L KCl、0.35 mmol/L KH2PO4、0.40 mmol/L MgSO4·7H2O、2.00 mmol/L乳酸鈣、2.00 mmol/L丙酮酸鈉、1.00 mmol/LL-谷氨酰胺、5.00 mmol/L 亞?；撬?、體積分數為2 %必需氨基酸(BME EAA)、體積分數為1 %非必需氨基酸(MEM NEAA)和3 g/L無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)；油紅染色液中含有0.15 g油紅O、30 mL異丙醇和20 mL H2O.實時熒光定量RT-PCR檢測所用的引物序列如表1所示.

表1實時熒光定量PCR引物

Tab.1Theprimersofreal-timefluorescentquantitativePCR

引物引物序列(5'→3')產物長度/bpHslTCCAAATCCCACGAGCCTTA159GAGGAGACCGCAGTGCTTGAAtglATGGAGCCCACGGACCTG179CTGCCTGTCTGCTCCTTTATCCActbAGGGCAGTAGCATCGCTTTAGT118AAGGGGATTGTGATGGCTGA

1.2 試驗方法

1.2.1 不同質量濃度左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟及其孤雌胚胎體外發(fā)育的影響 在無菌條件下收集卵巢表面直徑3～8 mm卵泡中的卵母細胞，并在顯微鏡下挑選胞質均勻、顆粒細胞3層以上的卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus oocytes complexes, COCs).然后，將采集的豬卵母細胞隨機分成4組，分別在添加不同質量濃度(0、10、100、1 000 ng/mL)左旋肉堿的成熟液中(每100 μL培養(yǎng)液培養(yǎng)20～30枚卵子)成熟培養(yǎng)42～46 h.用透明質酸酶(1 mg/mL)脫去成熟培養(yǎng)后COCs的卵丘細胞，在體視顯微鏡下檢查卵母細胞第一極體排出情況.之后，分別給予100 V/cm 、60 μs的直流脈沖進行孤雌激活.將電激后的卵母細胞轉入PZM-3中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第2天和第7天檢查胚胎卵裂和囊胚發(fā)育情況，并利用5 μg/mL Hoechst 33342對囊胚進行染色和細胞計數.

通過比較不同濃度左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟率(第一極體排出率)、卵裂率(卵裂數/激活卵數)、囊胚率(囊胚數/卵裂數)和囊胚細胞數的影響，從而確定左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟的影響，并篩選出其最佳添加質量濃度.

1.2.2 最佳成熟培養(yǎng)質量濃度左旋肉堿對卵母細胞脂肪代謝的影響 采用前期試驗篩選的最佳左旋肉堿添加質量濃度，以添加0 ng/mL作為對照組，并對豬卵母細胞進行成熟培養(yǎng).然后分別收集成熟培養(yǎng)后的卵母細胞，對其進行脂肪含量檢測和脂肪代謝關鍵酶類的表達檢測，以期明確左旋肉堿對豬卵母細胞脂肪代謝的作用效果和作用途徑.

首先，用油紅染色檢測豬卵母細胞內脂肪滴的含量.在各組中隨機選擇部分具有第一極體的成熟卵母細胞，放入質量分數為4%多聚甲醛中固定20 min后，用PVA-DPBS洗3遍.用油紅染色5～6 min后，用含體積分數為50%乙醇的DPBS過夜洗滌.第2天，將卵母細胞放到含適量PVA-DPBS的載玻片上，蓋上蓋玻片，在倒置顯微鏡下觀察并拍照.

然后，用試劑盒檢測卵母細胞的三酰甘油含量.分別收集300個0 和100 ng/mL左旋肉堿處理的成熟卵母細胞，置于40 μL含體積分數為1% Triton X-100的PBS中，4 ℃裂解40 min，隨后按照Dongou的三酰甘油測定試劑盒(浙江東甌診斷產品有限公司)說明書進行操作，利用酶標儀(BIO RAD-680)測定各樣品吸光度，并計算三酰甘油含量，試驗重復3次.

最后，用mRNA定量檢測成熟卵母細胞中脂肪酶基因(HSL)和三酰甘油水解酶基因(ATGL)的表達.分別收集100個0和100 ng/mL左旋肉堿處理的成熟卵母細胞，按照Tiangen公司的RNAprep pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒分別抽提這2組卵母細胞的總RNA，用PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉錄，合成cDNA第1鏈(40 μL/管).取1 μL cDNA為模板，以β-actin為內參，用實時熒光定量RT-PCR檢測試驗組與對照組間HSL和ATGL的mRNA表達水平，試驗均重復3次.

1.2.3 胚胎培養(yǎng)液中添加不同質量濃度左旋肉堿對豬孤雌胚胎體外發(fā)育的影響 在豬卵母細胞成熟培養(yǎng)液中不添加左旋肉堿而在早期胚胎體外培養(yǎng)液中添加不同質量濃度(0 、10 、100 、1 000 ng/mL)的左旋肉堿，通過48 h后胚胎卵裂率、7 d后的囊胚率和囊胚細胞數進行效果評價，從而篩選出適合胚胎培養(yǎng)的最佳添加質量濃度.

1.2.4 統(tǒng)計分析 所有試驗均重復3 次以上，統(tǒng)計數據用平均值±標準誤表示，應用SPSS 17.0 對試驗數據進行單因素方差分析，以P<0.05作為統(tǒng)計差異顯著的標準.

2 結果與分析

2.1 在成熟培養(yǎng)液中添加不同質量濃度的左旋肉堿對豬卵母細胞的影響

由表2可看出，與對照組及1 000 ng/mL組對比，添加100 ng/mL左旋肉堿可以顯著提高卵母細胞的體外成熟率(P<0.05).而在成熟液中添加左旋肉堿對卵裂率的影響不顯著(P>0.05)，但以添加100 ng/mL組的最高，并且其囊胚率和囊胚細胞數均較高(表2,圖1).由此可以認為添加一定質量濃度的左旋肉堿能夠提高卵母細胞的成熟率，最佳的添加質量濃度為100 ng/mL.

表2不同質量濃度左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活胚胎發(fā)育的影響1)

Tab.2EffectsofdifferentmassconcentrationsofL-carnitineonporcineoocytesmaturationandPAembryosdevelopmentinvitro

ρ(左旋肉堿)/(ng·mL-1)總卵數/枚卵母細胞成熟率/%電激卵數/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚細胞數/枚 0(對照)19356.65±1.68a17873.02±4.78a17.60±4.44ab33.67±11.79a1019963.13±3.30ab17768.32±3.97a21.35±6.22ab43.67±9.94a10020069.76±2.31b18877.37±4.11a29.15±4.22b40.33±3.71a100020456.60±3.27a18966.05±5.70a13.06±2.73a27.67±6.69a

1) 同列數據后，凡有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法).

A： 添加0 ng/mL左旋肉堿的囊胚 (100×)；B： 添加100 ng/mL左旋肉堿的囊胚(100×)；C： 添加0 ng/mL左旋肉堿的囊胚細胞數(200×)； D： 添加100 ng/mL左旋肉堿的囊胚細胞數(200×).

圖1 成熟液中添加左旋肉堿對豬孤雌胚胎發(fā)育和囊胚質量的影響

Fig.1 The influence of blastocysts quality and developmental ability of PA embryos derived from IVM medium supplemented withL-carnitine

2.2 成熟后卵母細胞中脂肪含量和三酰甘油含量檢測

如圖2所示，通過比較油紅染色后卵母細胞的顏色發(fā)現，添加100 ng/mL左旋肉堿試驗組的卵母細胞著色明顯較淺，表明其脂肪含量相對較低.進一步對0和100 ng/mL組的成熟卵母細胞中三酰甘油含量進行檢測，發(fā)現添加100 ng/mL左旋肉堿極顯著降低了卵母細胞中三酰甘油的含量(圖2)，與油紅O染色結果相一致，表明左旋肉堿能夠促進三酰甘油分解，具有促進豬卵母細胞脂肪代謝的作用.

A： 添加0 ng/mL左旋肉堿的卵母細胞(200×)；B： 添加100 ng/mL左旋肉堿的卵母細胞(200×)；C： 卵母細胞中三酰甘油含量(***表示在0.001水平上差異顯著，Duncan’s法).

圖2 成熟后的豬卵母細胞油紅O染色和三酰甘油含量檢測
Fig.2 Fat staining by oil red O and triglycerides content detection of mature oocytes

2.3 左旋肉堿對豬卵母細胞中脂肪代謝關鍵酶HSL和ATGL mRNA表達水平的影響

實時熒光定量結果顯示(圖3)，在成熟液中添加100 ng/mL的左旋肉堿后，其成熟卵母細胞中HSL和ATGL基因的mRNA表達水平均顯著地低于對照組(0 ng/mL).

2.4 在胚胎培養(yǎng)液中添加不同質量濃度的左旋肉堿對豬卵母細胞的影響

如表3所示，在胚胎培養(yǎng)液中添加一定質量濃度的左旋肉堿具有顯著提高豬孤雌胚胎卵裂率的作用(P<0.05)，且以添加100 ng/mL組的卵裂率和囊胚率最高.添加10 ng/mL左旋肉堿組的囊胚細胞數最多，但統(tǒng)計分析差異不顯著(P>0.05).

“**”表示在0.01水平上差異顯著，“***”表示在0.001水平上差異顯著(Duncan’s法).

圖3 左旋肉堿對豬卵母細胞HSL和ATGL基因 mRNA表達水平的影響

Fig.3 Effects ofL-carnitine supplementation onHSLandATGLmRNA expression levels of porcine oocytes

表3 胚胎培養(yǎng)液中不同質量濃度左旋肉堿對豬孤雌激活后胚胎發(fā)育能力的影響1)Tab.3 Effects of different concentrations of L-carnitine in embryo culture medium on porcine PA embryo development

1) 同列數據后，凡有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05,Duncan’s法).

3 討論與結論

研究發(fā)現，左旋肉堿為卵母細胞和胚胎利用脂肪酸提供了必不可少的輔助因子，在卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育中加入時可以提高胚胎的產出[5].同時，Lonergan等[9]認為胚胎的發(fā)育能力是判定卵母細胞質量的指標，Soom等[10]認為囊胚內細胞數多少表明了胚胎的發(fā)育能力強弱.本試驗通過在成熟液(或胚胎培養(yǎng)液)中添加不同質量濃度的左旋肉堿，發(fā)現左旋肉堿能夠顯著提高豬卵母細胞的體外成熟率、脂肪代謝以及孤雌激活卵裂率，并有助于提高豬孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率和囊胚質量.

目前文獻報道關于左旋肉堿對豬卵母細胞成熟培養(yǎng)和胚胎發(fā)育的影響濃度各不相同.Wu等[8]發(fā)現，在成熟液中添加不同質量濃度(0、0.25、0.50、1.00 mg/mL)的左旋肉堿對于成熟率影響不顯著，添加0.50 mg/mL左旋肉堿顯著提高囊胚率和減少囊胚細胞死亡數；而在胚胎培養(yǎng)液中添加不同質量濃度(0、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL)的左旋肉堿對于豬孤雌胚胎卵裂率和細胞數目無顯著影響.Somfai等[4]研究發(fā)現，在成熟液中添加質量濃度0.6～5.0 mg/mL的左旋肉堿可以顯著提高卵母細胞的成熟率和卵裂率，但對于其囊胚率無顯著性影響.而本研究發(fā)現，在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉堿能夠顯著地提高豬卵母細胞的成熟率，但對于其卵裂率和囊胚率卻沒有顯著影響；在胚胎培養(yǎng)液中添加10、100和1 000 ng/mL的左旋肉堿能顯著地提高豬孤雌胚胎卵裂，添加不同質量濃度左旋肉堿對于豬囊胚的發(fā)育沒有顯著性影響.產生這種差異的原因可能是基礎培養(yǎng)體系的不同造成的.

此外，本研究發(fā)現，左旋肉堿可以顯著降低成熟豬卵母細胞中三酰甘油的含量.已有大量的研究證明左旋肉堿能夠提高線粒體活力，通過增加β-氧化作用來提高卵母細胞和胚胎的發(fā)育[4-5].左旋肉堿主要是在肉堿脂酰轉移酶Ι的作用下，其3-羥基與脂酰CoA的?；Y合生成脂酰肉堿，隨后在移位酶的作用下從細胞質進入到線粒體內部.在線粒體內部，肉堿脂酰基轉移酶Ⅱ催化其分開，重新形成的脂酰CoA可不斷進行β-氧化，進而促進脂肪代謝[11].脂肪的主要成分是三酰甘油，ATGL只水解三酰甘油，對甘油二酯不起作用，而HSL水解甘油二酯的活性是三酰甘油的10倍[12-13]，因而三酰甘油水解的起始受ATGL限速.其主要過程是ATGL特異性地將三酰甘油分解為甘油二酯，產物進而被HSL水解為甘油一酯，隨后在甘油一酯酶的作用下形成甘油和脂肪酸[14].本研究發(fā)現，在成熟培養(yǎng)液中添加100 ng/mL左旋肉堿，在降低豬成熟卵母細胞中三酰甘油含量的同時也顯著降低了HSL和ATGL基因的mRNA表達水平，表明左旋肉堿促進三酰甘油代謝的作用并非是通過HSL和ATGL基因 mRNA表達水平的升高實現的.據李玉成[15]報道，脂肪細胞ATGL基因 mRNA表達水平的升高并不伴隨著ATGL表達蛋白的升高.本研究通過油紅染色發(fā)現，在成熟液中添加左旋肉堿可以促進豬卵母細胞的脂肪代謝，從而影響卵母細胞的質量和胚胎發(fā)育能力，但其具體作用機制仍需要進一步研究.

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【責任編輯柴 焰】

EffectsofL-carnitineonoocytesinvitromaturation,lipidmetabolismandparthenogeneticembryosdevelopmentinporcine

FENG Meiying, LI Guihuan, XU Zhenpeng, BAI Yinshan, WANG Wencong, LI Li , ZHANG Shouquan, WEI Hengxi

(College of Animal Science, South China Agricultural University/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding, Guangzhou 510642, China)

【Objective】This study was conducted to explore the effect of different concentrations ofL-carnitine on the maturation of porcine oocytes, the development of parthenogenetic (PA) embryosinvitroand the lipid metabolism in pig oocytes.【Method】 Different concentrations ofL-carnitine were added into mature medium to observe the influence on porcine oocytes maturation and parthenogenetic embryos development.Oil red staining, triacylglycerol kit and quantitative RT-PCR were used to detect the lipid metabolism and the key hydrolase expression level in oocytes.【Result and conclusion】 The rates of oocytes maturation and the subsequent PA blastocysts increased significantly when supplemented with 100 ng/mLL-carnitine to the IVM medium (P<0.05), and the oocytes lipid metabolism also increased significantly (P<0.001).The addition of 100 ng/mLL-carnitine into embryo culture medium significantly increased the cleavage rates (P<0.05) and contributed to the PA blastocyst rates and qualities.Further analyses of quantitative RT-PCR revealed that the mRNA expression levels of adipose triglyceride lipase gene (ATGL) and hormone-sensitive triglayceride lipase gene (HSL) both decreased significantly with 100 ng/mLL-carnitine treatment, which indicated that theL-carnitine could affect the lipid metabolism by regulating the key lipases gene expression.In conclusion, these results demonstrated thatL-carnitine can improve porcine oocytes maturation and enhance the PA embryos developmental ability through lipid metabolism regulation.

porcine oocytes;L-carnitine; parthenogenetic activation; lipid metabolism; embryo development

2014- 02- 20優(yōu)先出版時間2014- 10- 03

優(yōu)先出版網址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20141003.1118.007.html

馮美瑩(1989—)，女，碩士研究生, E-mail：jony.ya@163.com；通信作者：衛(wèi)恒習(1980—)，男，副研究員，E-mail：weihengxi@163.com

國家科技支撐計劃(2011BAD19B03)；廣東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬創(chuàng)新團隊(粵農〔2009〕380號)；東莞市科技計劃項目(201208102049)

馮美瑩, 李桂煥, 徐振鵬，等.左旋肉堿對豬卵母細胞體外成熟、脂肪代謝和孤雌胚胎發(fā)育的影響[J].華南農業(yè)大學學報，2014,35(6):8- 12.

S828

A

1001- 411X(2014)06- 0008- 05