異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及腦組織Caspase-3表達(dá)的影響

孫正清 蘇芳 蓋成林 楊天德

·論著·

異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及腦組織Caspase-3表達(dá)的影響

孫正清 蘇芳 蓋成林 楊天德

目的探討異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)的影響，為異丙酚的臨床應(yīng)用提供更為重要的科學(xué)依據(jù)。方法24只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、冷凍傷后0.9%氯化鈉溶液組和異丙酚組。異丙酚給藥量為臨床麻醉相關(guān)劑量(100 mg/kg)：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量。采用顱骨外腦冷凍傷法，運(yùn)用液氮冷凍器局部冷凍大鼠左側(cè)頂部腦組織60 s制作冷凍傷即腦損傷模型。3組傷后24 h采用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,采用免疫組化法測(cè)定Caspase 3蛋白表達(dá),并進(jìn)行神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分。結(jié)果異丙酚組神經(jīng)細(xì)胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液組比較降低(P<0.05)，但仍顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。腦冷凍傷后24 h，0.9%氯化鈉溶液組Caspase 3蛋白陽性表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)，異丙酚組腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低(P<0.05) 。腦冷凍傷后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，傷后24 h異丙酚治療組神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分(NSS)明顯低于0.9%氯化鈉溶液治療(P< 0.05)。結(jié)論臨床麻醉相關(guān)劑量的異丙酚可以減輕腦損傷后延遲性神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

異丙酚；腦創(chuàng)傷；凋亡；Caspase 3

顱腦損傷是一種較為嚴(yán)重復(fù)雜的腦創(chuàng)傷，是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者傷殘及死亡的重要原因。目前認(rèn)為，腦損傷引起的急性期神經(jīng)元死亡是以壞死為主，而繼發(fā)死亡或遲發(fā)性死亡則以凋亡為主，前者發(fā)生在缺血后早期的中心區(qū)，后者多發(fā)生在缺血后的半影區(qū)，大約50%的神經(jīng)細(xì)胞死亡是凋亡[1]。異丙酚作為一種常用的臨床麻醉及重癥患者鎮(zhèn)靜用藥，隨著對(duì)其藥理特性的深入研究，其抗氧化及腦保護(hù)作用已逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。本研究采用腦冷凍傷這一經(jīng)典的腦創(chuàng)傷模型，以異丙酚腹腔注射為干預(yù)，觀察異丙酚對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)的影響，為異丙酚的臨床應(yīng)用提供更為重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性 Wistar 大鼠24只，體重230～250 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪野戰(zhàn)外研所提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組：只切開頭皮而未行冷凍傷處理；冷凍傷后0.9%氯化鈉溶液組：冷凍傷后15 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 ml/kg,0.5 h后再次追加相同劑量；異丙酚組：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量。每組8只大鼠，3組傷后24 h進(jìn)行神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分，之后處死動(dòng)物，收集腦組織標(biāo)本運(yùn)用TUNEL技術(shù)進(jìn)行凋亡檢測(cè),采用免疫組化法測(cè)定Caspase 3蛋白表達(dá)。

1.2 動(dòng)物模型制備 按照參照文獻(xiàn)[2]的方法制備動(dòng)物模型。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，待角膜及翻正反射消失后，俯臥位固定于立體定位儀上，碘氟消毒頭部皮膚，沿正中切開頭皮，分離骨膜，暴露左頂顱骨。將內(nèi)盛丙酮的冷凍器直接浸泡入液氮中預(yù)冷，使冷凍器溫度為液氮溫度(-196℃)。將直徑5 mm冷凍頭垂直置于矢狀縫左旁開5.5 mm為圓心的骨面上(冷凍頭前緣至冠狀縫)，冷凍60 s，造成左頂葉腦皮層的冷凍傷。手術(shù)室溫度為25℃，術(shù)中電燈泡照射維持肛溫為37～37.5℃。術(shù)畢自由進(jìn)食水。

1.3 TUNEL法腦組織凋亡檢測(cè) 冷凍傷后24 h,3組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉，剪開胸前臂，暴露心臟，經(jīng)左室插入靜脈針頭直達(dá)主動(dòng)脈，快速灌注肝素生理鹽水，剪開右心耳放血，待流出液體清亮后(約需0.9%氯化鈉溶液200 ml)，再以4%多聚甲醛溶液灌注45 min，約300 ml固定。迅即斷頭取腦，以凍傷灶為中心切取冠狀腦組織塊，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h,移入30%蔗糖溶液置4℃脫水24 h至沉底。脫水后的標(biāo)本于冰凍切片機(jī)預(yù)冷后做冠狀面切片，每個(gè)標(biāo)本切片6張，切好的標(biāo)本放于冰箱中冷藏備用。TUNEL法檢測(cè)程序，按照試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)使用說明書程序進(jìn)行。TUNEL陽性細(xì)胞胞核中呈現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性對(duì)照細(xì)胞核藍(lán)染。每只大鼠選取一張腦切片，在400倍光鏡下，隨機(jī)取傷灶周圍皮質(zhì)10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出平均陽性率，即得AI(apoptosis index)。計(jì)算公式為：凋亡指數(shù)(AI)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 腦組織Caspase 3蛋白表達(dá) 取上述冷藏備用的冰凍切片,采用SABC法行Caspase 3蛋白免疫組織化學(xué)染色,選用北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Caspase 3單克隆抗體，操作程序參照說明書進(jìn)行．鏡下觀察胞漿有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。采用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Leica Qwin，德國)，進(jìn)行分析。每組隨機(jī)選擇8張免疫組化染色片(免疫組化染色強(qiáng)度大致一致)，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，用圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以平均灰度值代表蛋白表達(dá)水平：蛋白表達(dá)強(qiáng)則灰度值低，反之則高。

1.5 神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分(Neurological severity score，NSS) 參照Shapira等[3]制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，從運(yùn)動(dòng)、反射、行為、功能測(cè)試等項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)分。觀察在一個(gè)寬敞的房間中進(jìn)行，觀察者為非實(shí)驗(yàn)者，0分為最低分，表示未受損傷，25分為最高分，表示損傷最為嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果 顱腦冷凍傷后24 h，TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞呈圓形、皺縮，核固縮，整個(gè)細(xì)胞著色深，細(xì)胞核內(nèi)有較強(qiáng)的TUNEL陽性染色，而細(xì)胞漿內(nèi)TUNEL陽性染色較少，為凋亡神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)。主要位于凍傷灶周圍。 假手術(shù)組腦組織及凍傷對(duì)側(cè)未見或只見極少量散在的凋亡細(xì)胞，這可能是正常的生理死亡。在腦冷凍傷后24 h，異丙酚組凍傷灶周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但仍顯著高于假手術(shù)組(P< 0.01)。見表1、圖1～3。

2.2 Caspase 3蛋白表達(dá)結(jié)果 Caspase 3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。假手術(shù)組皮層Caspase 3染色陽性細(xì)胞較少。腦冷凍傷后24 h，0.9%氯化鈉溶液組Caspase 3蛋白陽性表達(dá)水平(蛋白表達(dá)強(qiáng)則灰度值低，反之則高)較假手術(shù)組明顯升高。陽性細(xì)胞表達(dá)主要來源于凍傷灶周圍缺血半暗帶區(qū)。異丙酚組腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見表1、圖4～6。

表1 冷凍傷后24 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)及腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)灰度值 n=8

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,#P<0.01;與0.9%氯化鈉溶液組比較，△P<0.05

圖1 腦冷凍傷后24 h0.9%氯化鈉溶液組(TUNEL×400)圖2 腦冷凍傷后24 h異丙酚組(TUNEL×400)圖3 假手術(shù)組(TUNEL×400)

圖4 假手術(shù)組Caspase-3(免疫組化×400) 圖5 腦冷凍傷后24 h 0.9%氯化鈉溶液組Caspase-3(免疫組化×400) 圖6 腦冷凍傷后24 h異丙酚組Caspase-3(免疫組化×400)

2.3 神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分(NSS)結(jié)果 在冷凍傷后6 h 0.9%氯化鈉溶液組NSS為5.25±1.03，隨時(shí)間延長逐漸降低，傷后24 h異丙酚組明顯低于0.9%氯化鈉溶液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組NSS為0，表示無神經(jīng)功能障礙。見表2。

表2神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分

組別凍傷后6h凍傷后24h假手術(shù)組0.00±0.000.00±0.000.9%氯化鈉溶液組5.25±1.033.00±0.76*異丙酚組—1.88±0.64#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01;與0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.05

3 討論

依據(jù)既往的報(bào)道,腦冷凍傷后皮質(zhì)細(xì)胞凋亡于24 h達(dá)到高峰,并認(rèn)為凋亡性細(xì)胞死亡促成了繼發(fā)性腦損傷，腦冷凍傷模型也是一個(gè)簡(jiǎn)易的可用來研究創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的模型[4，5]。鑒于以上研究，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TUNEL技術(shù)觀察腦冷凍傷后24 h的神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織存在極少量散在的凋亡細(xì)胞，這可能是正常的生理死亡。顱腦冷凍傷后24 h(0.9%氯化鈉溶液組)，皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞壞死主要位于凍傷灶中心區(qū)內(nèi)，而表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞特點(diǎn)的TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞主要位于凍傷灶周圍,呈散在分布。上述特點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下述因素有關(guān)：腦冷凍傷后凍傷灶中央?yún)^(qū)的神經(jīng)細(xì)胞很快就會(huì)因?yàn)槿毖毖醵鴫乃?。而周圍區(qū)是非直接遭受凍傷的部位，即所謂缺血半影區(qū),缺血程度要輕于中央?yún)^(qū)，細(xì)胞處于相對(duì)靜息垂死狀態(tài)，離子傳遞受到抑制，能量合成減少，內(nèi)環(huán)境改變較緩慢，細(xì)胞內(nèi)鈣離子緩慢升高，再灌注時(shí)自由基等在此明顯堆積,內(nèi)源性凋亡調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

同時(shí)，我們也觀察了異丙酚對(duì)腦冷凍傷后神經(jīng)細(xì)胞延遲性凋亡的影響。研究結(jié)果顯示，在腦冷凍傷后24 h，異丙酚治療組凍傷灶周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液治療組比較顯著降低，但仍顯著高于假手術(shù)組。說明異丙酚對(duì)腦冷凍傷后神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡有保護(hù)作用。目前創(chuàng)傷性腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不完全清楚?，F(xiàn)有的資料表明，細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白如caspase家族在凋亡過程中起著必不可少的作用，特別caspase-3處于核心位置，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子[6],在本研究中，腦冷凍傷后24 h，生理鹽水組Caspase 3蛋白陽性表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，與既往研究結(jié)果[7]一致,異丙酚治療組腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，說明異丙酚可能通過降低腦組織Caspase 3蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡作用。近年來，有關(guān)異丙酚對(duì)缺血性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響已有所報(bào)道。研究顯示在腦缺血再灌注損傷異丙酚可以通過上調(diào)腦組織bcl-2表達(dá)、下調(diào)Caspase 3表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡作用[8]。有關(guān)異丙酚對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的作用效應(yīng)研究還較少。近期在創(chuàng)傷性腦損傷的離體模型的研究表明，異丙酚可劑量依賴性地減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷,復(fù)合淺低溫效果更顯著[9]。國內(nèi)王顯望等[10]研究顯示在自由落體腦創(chuàng)傷異丙酚可減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡,支持本研究結(jié)果。我們的研究顯示異丙酚可減輕腦冷凍傷后神經(jīng)細(xì)胞延遲性凋亡，推測(cè)可能與異丙酚抗氧化、調(diào)節(jié)Ca2+平衡、減輕興奮性氨基酸堆積進(jìn)而影響凋亡調(diào)節(jié)蛋白如Caspase 3的表達(dá)有關(guān)。但確切的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，行為學(xué)評(píng)分是對(duì)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)藥物治療效果和神經(jīng)功能恢復(fù)的重要補(bǔ)充。神經(jīng)創(chuàng)傷評(píng)分(NSS)表明了鼠受傷后神經(jīng)功能狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道，異丙酚可以改善缺血性腦損傷近期及遠(yuǎn)期的神經(jīng)功能的恢復(fù)[11]。魏興等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，腦冷凍傷1 h NSS最高，之后漸下降，表明有部分神經(jīng)功能自主恢復(fù)，麻醉藥氯胺酮可以明顯減輕傷后24 h NSS評(píng)分，促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究顯示，臨床麻醉劑量的異丙酚可明顯減輕傷后24 h NSS評(píng)分，表明異丙酚可促進(jìn)腦冷凍傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

在本研究中，因?qū)嶒?yàn)條件的限制，異丙酚以腹腔注射為干預(yù)，應(yīng)用劑量為臨床麻醉相關(guān)劑量。至于異丙酚影響腦損傷后繼發(fā)損害的量效關(guān)系、治療的時(shí)間窗和具體的作用機(jī)制，需要采用更為先進(jìn)的給藥方式，如微泵恒速給藥或靶控輸注技術(shù)，進(jìn)一步深入探討。

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TheeffectofpropofolondelayedneuronalapoptosisandCaspase3expressionafterbraininjuryinrats

SUNZhengqing,SUFang,GAIChenglin,etal.DepartmentofAnesthesiology,No.230HospitalofPLA,Liaoning,Dandong118000,China

ObjectiveTo explore the effect of propofol on delayed neuronal apoptosis and Caspase 3 expression after brain injury in rats in order to provide important scientific basis for clinical application of propofol.MethodsTwenty-four health male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,physiological saline treatment group after brain injury,propofol treatment group after brain injury.Propofol was injected intraperitoneally in a dose of 100mg/kg which was equivalent to clinical dose for general anesthesia,in which 50mg/kg propofol was administered ip 15min after brain freezing injury,and another 50mg/kg propofol was injected at 30min after the first injection.The freezing -induced brain injury models in Wistar rats were established by freezer (pre-cold in liquid nitrogen with the temperature at -196℃)-induced brain injury in Wistar rats on the left parietal side of skull of rat for 1 min.Apoptosis of neural cells was detected by TUNEL,and the expression of Caspase 3 protein in brain of rats was detected by immunohistochemistry,moreover,neurological severity score (NSS) was evaluated 24 hours after brain injury.ResultsThere was a significant difference in nerve cell apoptosis between propofol treatment group and physiological saline treatment group (P<0.05),furthermore,the apoptosis cells in both groups were significantly more than those in sham-operation group (P<0.01).24 hours after brain freezing injury,the expression levels of Caspase 3 protein in physiological saline treatment group were significantly higher than those in sham-operation group (P<0.01),however,which in propofol treatment group were significantly lower than those in physiological saline treatment group (P<0.05).After brain freezing injury,nerve function disturbance occurred in rats,24 hours after brain injury,the NSS in propofol treatment group were significantly lower than that in physiological saline treatment group (P<0.05).ConclusionPropofol in clinical dose for general anesthesia can reduce delayed neuronal apoptosis,promote recovery of nerve function after brain injury.

propofol；brain injury；apoptosis；Caspase 3

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.006

118000 遼寧省丹東市，中國人民解放軍第230醫(yī)院麻醉科(孫正清、蘇芳、蓋成林)；第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院麻醉科(楊天德)

楊天德，400038 重慶市，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院麻醉科；

E-mail:31011@sina.com

R 971.2

A

1002-7386(2014)12-1777-04

2013-12-27)