人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選

強(qiáng) 薇，郭 帥，張愛(ài)華，雷鋒杰，匙 坤，王 壯，王二歡，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130118)

人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選

強(qiáng) 薇，郭 帥，張愛(ài)華，雷鋒杰，匙 坤，王 壯，王二歡，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130118)

【目的】篩選對(duì)人參主要病原菌拮抗率更高、抑菌譜更廣的新菌株生防菌種資源.【方法】稀釋平板法分離拮抗菌；平板對(duì)峙法篩選拮抗菌.【結(jié)果和結(jié)論】篩選出對(duì)人參單一病原菌有高拮抗活性的放線(xiàn)菌7株，對(duì)人參疫病、菌核病、灰霉病、黑斑病、銹腐病、立枯病、根腐病拮抗率分別為80.84%、82.46%、66.08%、71.33%、64.63%、85.53%、65.11%，其中對(duì)7大人參病害均有高拮抗活性的菌株有5株，包括1株木霉菌、4株放線(xiàn)菌.研究結(jié)果表明，可利用人參根際土壤中的有益菌研究其生防潛力，用于人參主要病害的防治.

菌株篩選； 拮抗菌； 人參; 病原菌； 根際微生物

人參PanaxginsengC. A. Mey為五加科名貴中藥材，需要種植5～6年才能收獲.人參病害主要以根部病害為主，也伴有一些地上莖葉的病害，根部病害發(fā)病率20%左右，重者高達(dá)70%以上，嚴(yán)重影響了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)，削弱了我國(guó)人參產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力[1].目前我國(guó)人參病害主要依靠化學(xué)殺菌劑防治，殺菌劑在土壤中的有效期為1個(gè)月左右，容易造成化學(xué)農(nóng)藥污染.利用微生物拮抗菌株防治人參病害可以1次施用，多年有效，對(duì)人參和周邊環(huán)境不會(huì)造成化學(xué)殘留，是人參病害防治的發(fā)展方向[2-5].

我國(guó)在人參病害拮抗菌篩選方面做了較多工作，得到了一些對(duì)人參病害有拮抗作用的有益菌株[6]，并且取得了較好的防治效果[7- 8]，但是，這些拮抗菌大多數(shù)只作用于1種人參病害、或是同時(shí)作用于2～3種人參病害，不能滿(mǎn)足實(shí)際防治需要，防治效果也不很理想.本試驗(yàn)從我國(guó)人參主產(chǎn)區(qū)的人參根際土壤中進(jìn)行了大量拮抗菌的篩選，以期分離出拮抗效果更好、抑菌譜更廣、同時(shí)對(duì)7大人參主要病害有抑制作用的優(yōu)良菌株，從而擴(kuò)大生防菌種資源，為開(kāi)發(fā)防治人參病害殺菌劑提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：放線(xiàn)菌的分離培養(yǎng)采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基；木霉菌的分離培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基；拮抗菌篩選采用PDA培養(yǎng)基.

人參病原菌：疫病菌Phytophthoracactorum、菌核菌Sclerotiniaschinseng、灰霉菌BotrytiscinereaPers、黑斑菌Alternariapanax、銹腐菌Cylindrocarpondestructans、立枯菌Rhizoctoniasolani、根腐菌Fusariumsolani，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參研究工程中心實(shí)驗(yàn)室提供.

土樣：集安(3、4、5年生)、靖宇(4、5年生)、撫松(4、5、6年生)、長(zhǎng)白(5、6、7年生)等人參主產(chǎn)地的不同年生人參根際土壤，2次采樣時(shí)間分別為2012年5月和9月，共采集土樣58份，4℃冰箱保存?zhèn)溆?

木霉菌：sTHB和sTV04，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參研究工程中心實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離 采用稀釋平板法對(duì)土壤中的微生物進(jìn)行分離，取0.5 mL相應(yīng)稀釋濃度的菌懸液用涂布棒分別涂到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取不同形態(tài)的單菌落，純化后保存.其中，木霉菌稀釋度為10-3、10-4、10-5，25 ℃培養(yǎng)24～48 h；放線(xiàn)菌的稀釋度為10-3、10-4、10-5,28 ℃培養(yǎng)48～72 h；每個(gè)稀釋度重復(fù)3次.

1.2.2 拮抗放線(xiàn)菌的篩選 將人參病原菌用打孔器制成直徑為5 mm的菌塊接種于中心，挑取放線(xiàn)菌在距離中心等距離的兩側(cè)劃線(xiàn).以只接病原菌的PDA平板作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次.28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，初步篩選出對(duì)人參病原菌有拮抗作用的菌株，將這些拮抗菌株純化，保存，待測(cè).

1.2.3 拮抗木霉菌的篩選 將人參病原菌和拮抗菌株分別用打孔器制成直徑為5 mm的菌塊，并將人參病原菌和拮抗菌分別接種于距中心等距離的PDA平板的兩側(cè).以只接病原菌的PDA平板作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次.25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，初步篩選出對(duì)人參病原菌有拮抗作用的菌株，將這些拮抗菌株純化、保存、待測(cè).

1.2.4 拮抗放線(xiàn)菌的抑菌活性測(cè)定 將有抑菌作用的拮抗菌株做進(jìn)一步篩選.在PDA培養(yǎng)皿中心接種培養(yǎng)48 h的人參病原菌菌餅(直徑5 mm)，用接種針蘸取培養(yǎng)48 h的拮抗菌，以病原菌菌餅為中心，在PDA培養(yǎng)基上劃等邊三角形，這3條細(xì)線(xiàn)的豎行作為3次重復(fù)數(shù)據(jù)，以只接種病原菌的PDA平板為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)72～96 h左右，待對(duì)照接近長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿時(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各個(gè)培養(yǎng)皿中人參病原菌的菌落生長(zhǎng)半徑，按下面公式計(jì)算拮抗率：

拮抗率=(對(duì)照病原菌凈生長(zhǎng)半徑-拮抗菌作用后的病原菌凈生長(zhǎng)半徑)/對(duì)照病原菌凈生長(zhǎng)半徑×100%.

1.2.5 拮抗木霉菌抑菌活性測(cè)定 采用兩點(diǎn)對(duì)峙法(方法同1.2.2)，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，待對(duì)照接近長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各個(gè)培養(yǎng)皿中人參病原菌的菌落生長(zhǎng)半徑，計(jì)算拮抗率.

1.3 數(shù)據(jù)分析

Excel 2003錄入數(shù)據(jù)，DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和對(duì)7種人參病原菌的拮抗作用

從土壤中分離得到226株放線(xiàn)菌、35株木霉菌，其中篩選出有拮抗作用的放線(xiàn)菌25株、木霉菌8株.而其余的201株放線(xiàn)菌和27株木霉菌沒(méi)有拮抗作用(表1).

表1拮抗菌對(duì)人參疫病、菌核、灰霉、黑斑病、銹腐、立枯、根腐病病原菌的拮抗率

Tab.1TheantagonisticrateofantagonisticstrainsonpathogensofPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,Cylindrocarpondestructans,RhizoctoniasolaniandFusariumsolani

1)首字母A、B為放線(xiàn)菌；首字母m為木霉菌.

對(duì)人參疫病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有21株、木霉菌5株；拮抗率均達(dá)到40%以上.放線(xiàn)菌A-A- 26-1對(duì)其拮抗率最高(80.84%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(78.68%).對(duì)人參菌核病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有9株、木霉菌1株；拮抗率達(dá)到40%以上.放線(xiàn)菌A-34對(duì)其拮抗率最高(82.46%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(41.39%).對(duì)人參灰霉病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有8株、木霉菌1株；拮抗率達(dá)到10%以上.放線(xiàn)菌A-38對(duì)其拮抗率最高(66.08%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(71.76%).對(duì)人參黑斑病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有23株、木霉菌1株；拮抗率達(dá)到30%以上.放線(xiàn)菌B- 4對(duì)其拮抗率最高(71.33%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(71.76%).對(duì)人參銹腐病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有22株、木霉菌6株；拮抗率達(dá)到10%以上，放線(xiàn)菌A-30對(duì)其拮抗率最高(64.63%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(80.56%).對(duì)人參立枯病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有5株、木霉菌1株；拮抗率達(dá)到50%以上，A- 47對(duì)其的拮抗率最高(85.53.%)；木霉菌mB153對(duì)其拮抗率最高(76.90%).對(duì)人參根腐病病原菌有拮抗作用的放線(xiàn)菌有28株、木霉菌2株；拮抗率達(dá)到10%以上，B-11- 45對(duì)其拮抗率最高(65.11%)；木霉菌mA-11對(duì)其拮抗率最高(49.81%).

2.2 拮抗菌株對(duì)7種人參病原菌的拮抗活性測(cè)定

4株高活性拮抗放線(xiàn)菌A-38、A-34、A-39、A- 47(表2、圖1)和1株高活性拮抗木霉菌株mB153(圖2)均同時(shí)對(duì)7種人參病原菌有較高的拮抗作用.其中，對(duì)人參疫病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A-39(71.0%)；對(duì)人參菌核病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A-34(82.4%)；對(duì)人參灰霉病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A-38(66.0%)；對(duì)人參黑斑病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A- 47(65.3%)；對(duì)人參銹腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A- 47(48.2%)；對(duì)人參立枯病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A- 47(85.5%)；對(duì)人參根腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線(xiàn)菌A-38(59.6%)；A- 25、A-30、A- 61、A-50、A-19拮抗放線(xiàn)菌同時(shí)對(duì)2種及2種以上的人參病原菌有不同程度的抑制作用.

表2 拮抗放線(xiàn)菌對(duì)7種人參病原菌的抑制作用1)Tab.2 The inhibition of antagonistic activity of Actinomyces on 7 ginseng pathogens %

1) 同行數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同小寫(xiě)字母者表示差異不顯著(P>0.05，LSD法).

a、b分別表示放線(xiàn)菌A- 47和A-39對(duì)人參黑斑病病原菌的拮抗效果；c：放線(xiàn)菌A-38對(duì)人參根腐病病原菌的拮抗效果；d：放線(xiàn)菌A-34對(duì)人參疫病病原菌的拮抗效果.

圖1 高活性菌株對(duì)人參病原菌的拮抗作用
Fig.1 Antagonistic effects of high activity strains on pathogens of ginseng

a、b、c、d分別表示木霉mB153對(duì)人參銹腐病、人參黑斑病、人參菌核病、人參根腐病病原菌的拮抗效果.

圖2 高活性拮抗木霉mB153對(duì)人參病原菌的拮抗效果

Fig.2 The antagonistic effect of a high antagonistic activityTrichodermamB153 on ginseng pathogens

3 討論與結(jié)論

人參病害從發(fā)生部位可以分為地上、表土中和地下部位.黑斑病、疫病、灰霉病屬于地上部位病害，立枯病屬于表土中的病害，銹腐病、根腐病、菌核病都屬于根部病害[9].邢云章等[10]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉菌對(duì)人參根腐病病原菌有抑制作用，本試驗(yàn)篩選出1株綠色木霉菌mB153對(duì)人參根腐病病原菌也有抑制作用.王慧等[11]從79 株木霉菌株中篩選出3株對(duì)人參銹腐病病原菌拮抗效果較好的菌株WCT- 01、WWZ22-11和Z- 67，3株木霉菌抑制率分別達(dá)到77.24%、76.08%和74.06%.ECT- 01- 2對(duì)人參銹腐病病原菌的抑制率高達(dá)83.68%[12].而本試驗(yàn)篩選的高活性木霉菌株(mB153)對(duì)人參銹腐病病原菌的抑制率達(dá)到80.56%.崔立萍等[13]研究篩選的5株拮抗菌對(duì)人參黑斑病病原菌的抑菌率達(dá)到70%～80%，而本試驗(yàn)篩選得到的4株高活性拮抗放線(xiàn)菌(A-38、A-34、A-39、A- 47)、1株木霉(mB153)對(duì)人參黑斑病、人參銹腐病的抑制率均達(dá)到50%和38%以上，而且這5株高活性拮抗放線(xiàn)菌均對(duì)7大人參主要病害有較高的拮抗作用，與前人的研究相比較，這5株高活性拮抗菌的抑菌譜更寬，能同時(shí)降低多種人參病害的發(fā)生率，更能滿(mǎn)足人參多種病害同時(shí)發(fā)生的實(shí)際防治需要，具有巨大的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力.研究[14-16]發(fā)現(xiàn)一些有益綠色木霉、細(xì)菌的拮抗菌株同時(shí)對(duì)人參銹腐病、立枯病、疫病、黑斑病、灰霉病、根腐病、菌核病等常見(jiàn)人參病害有較高拮抗作用，但本試驗(yàn)篩選的拮抗菌的抑菌譜更寬.本試驗(yàn)篩選出的拮抗放線(xiàn)菌數(shù)量更多，而木霉菌拮抗率更高.

從微生物農(nóng)藥的成分上來(lái)看，單一的微生物殺菌劑的拮抗效果往往不好，表現(xiàn)在定植效果不好和使得病原菌產(chǎn)生抗性等方面；而采用復(fù)配、多種拮抗菌劑混合、添加有機(jī)添加劑[17]等方式更符合人參病害防治的實(shí)際需要.本試驗(yàn)中篩選的拮抗木霉菌株mB153對(duì)7大人參病害均有不同程度抑制作用，其中對(duì)人參銹腐病病原菌的拮抗率最高為：80.56%，對(duì)菌核病病原菌的拮抗率最低為：41.39%，對(duì)其他5種人參病原菌的拮抗率達(dá)41.39%～80.56%.供試木霉菌株sTHB對(duì)7大人參病害均有不同程度拮抗作用，對(duì)人參黑斑病病原菌的拮抗率最高為：83.58%，對(duì)人參菌核病病原菌的拮抗率最低為：53.83%，對(duì)其他5種人參病原菌的拮抗率均在53.83%～83.58%.供試木霉菌株sTV04對(duì)人參銹腐病病原菌拮抗率最高為：84.67%，對(duì)人參菌核病病原菌的拮抗率最低為48.35%，但對(duì)人參疫病病原菌無(wú)抑制作用，而對(duì)其他4種人參病原菌的拮抗率均在48.35%～84.67%.本試驗(yàn)篩選出的拮抗菌株mB153對(duì)人參病原菌的拮抗率雖然低于實(shí)驗(yàn)室供試菌株，但是仍然具有一定的應(yīng)用防效價(jià)值.研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室保存的木霉菌sTHB、sTV04和本試驗(yàn)篩選的拮抗木霉菌株mB153對(duì)人參菌核病病原菌均表現(xiàn)出最低的拮抗率，可以考慮將3種木霉菌制成混合劑型的微生物殺菌劑，以期能更好的防治人參菌核病.本試驗(yàn)的拮抗菌均分離自人參根際土壤，這一點(diǎn)，對(duì)于后續(xù)菌株的定植會(huì)占有一定優(yōu)勢(shì)，這與Timmusk等[18]研究結(jié)果是類(lèi)似的，因此具有很好的研究和開(kāi)發(fā)前景.關(guān)于拮抗菌株的鑒定、生防制劑、抗菌活性物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及生防菌株的混合使用技術(shù)還需要進(jìn)一步研究.

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【責(zé)任編輯霍 歡】

ScreeningantagonisticmicroorganismsagainstginsengdiseasesfromPanaxginsengrhizospheresoil

QIANG Wei, GUO Shuai, ZHANG Aihua, LEI Fengjie, CHI Kun, WANG Zhuang, WANG Erhuan, ZHANG Lianxue

(College of Chinese Traditional Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

【Objective】 To expand biocontrol strain resources and screen new strains with a higher antagonistic rate and a wider inhibiting range to control ginseng diseases. 【Method】 The antagonistic strains were isolated by dilution plate method and were screened by flat-stand method.【Result and conclusion】 Seven actinomycetes strains with higher antagonistic activities to single ginseng pathogen, such asPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,CylindrocarpondestructansRhizoctoniasolaniandFusariumsolani, had been screened, whose inhibition rates were 80.84%, 82.46%, 66.08%, 71.33%, 64.63%, 85.53% and 65.11%, respectively. Five strains, including a strain ofTrichodermaand four strains ofActinomyces, had higher antagonistic activities to seven kinds of ginseng pathogens. The results indicate that the beneficial strains in the rhizosphere has a biocontrol potential ability of ginseng pathogens and can be used to prevent and cure major diseases of ginseng.

screen strains; antagonist strain; ginseng; pathogen; rhizosphere microbial

2013- 11- 28優(yōu)先出版時(shí)間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0907.014.html

強(qiáng) 薇(1986—)，女，碩士研究生，E-mail: 1263785469@qq.com：通信作者：張連學(xué)(1955—)，男，教授，博士，E-mail: zlx863@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070316，31100239，31200224); 國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃子課題(2006BA109804- 02)； 國(guó)家公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201303111)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20110926，20130206030YY)

強(qiáng) 薇，郭 帥，張愛(ài)華，等.人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,35(5):76- 81.

S482.292

A

1001- 411X(2014)05- 0076- 06